т определять и a-D-глюкозу. Для проверки возможного влияния солей и других ингибиторов в каждый неизвестный раствор целесообразно добавлять стандарт без углеводов.

17.2.5. Гликоген

Оценить содержание у бактерий любого простого полисахарида, кроме гликогена, с помощью несложных методик довольно трудно. Здесь мы опишем способ выделения гликогена, так как этот полимер служит резервным материалом у многих бактерий и может составлять значительную часть их биомассы. Способы выделения других широко распространенных сложных полисахаридов (липополисахаридов и пептидогликанов) приведены в других разделах. Гликоген, как и другие полисахариды, устойчив к гидролизу щелочами, он хорошо растворим в воде и нерастворим в этаноле. Выделение полимера основано на использовании именно этих свойств. Содержание глюкозы в выделенном гликогене можно определить в кислотных гидролизатах с помощью реакций с антроном или фенолом или с помощью глюкозоок-сидазного теста после б-часового гидролиза полисахарида в 4 н. НС1 при 100 °С в запаянной ампуле.

Реактивы и оборудование Абсолютный этанол.

Гидроксид калия: 30%-ный (вес/объем) раствор в дистиллированной воде. (Осторожно: щелочь! Нельзя насасывать раствор в пипетку ртом. Следует избегать попадания реактива на кожу и в гла* за.)

Центрифуга с охлаждением, работающая со скоростями до 10 ООО g.

30-мл стеклянные центрифужные пробирки.

Методика

Клетки собирают центрифугированием при 5000— 10000 g в течение 15 мин, ресуспендируют в равном объеме физиологического раствора и снова центрифугируют. Еще раз промывают клетки, центрифугируют и лиофилизуют их (разд. 12.2.1). 100 мг сухих клеток помещают в пирексовую или кимаксовую пробирку, имеющую завинчивающуюся крышку с тефлоновой прокладкой, вносят в нее 1 мл 30%-ного КОН и инкубируют в паровой или кипящей бане в течение 3 ч при 100 °С. Если лиофилизация нецелесообразна, суспендируют 500 мг сырых клеток в 0,6 мл 50%-ного (вес/объем) КОН и нагревают при 100 °С для солюбилизации гликогена. Охлаждают пробирку, не открывая ее. После охлаждения добавляют 3 мл дистиллированной воды и 8 мл этанола для осаждения гликогена. Центрифугируют при 10000 g в течение 15 мин и осадок промывают 8 мл 60%-ного охлажденного этанола путем центрифугирования. Высушивают осадок в вакуумном эксикаторе. В промытом осадке можно определить глюкозу ант-роновым или фенольным методом (разд. 17.2.1 и 17.2.2). Можно также провести гидролиз для получения глюкозы и дальнейшего ее определения по глюкозооксидазной методике (разд. 17.2.3). Для полной экстракции гликогена из грамположительных клеток иногда требуется их механическое разрушение [9],

17.2.6. Определение гексозаминов в очищенных пептидогликанах [5, 8—12]

Гексозамины присутствуют в липополисахаридах, пептидогликанах и тейхоевых кислотах бактерий. Наиболее распространенные гексозамины — это глюкозамин, галактозамин и мурамовая кислота. Все N-ацетилиро-ванные гексозамины реагируют с л-диметиламинобен-зальдегидом, вызывая образование продукта, окрашенного в красный цвет. Этот тест очень чувствителен п специфичен для гексозаминов, однако он не позволяет дифференцировать глюкозамин, мурамовую кислоту и? галактозамин. Мурамовую кислоту можно определять отдельно с помощью других методик (разд. 17.2.8).

Модифицированная методика Гуйзена и др. [11] более точна и удобна, чем описанная ниже методика Моргана— Элсона. Она позволяет определять суммарные гексозамины в очищенных пептидогликанах. Однако для определения гексозаминов в сложных полимерах или бактериальных клетках требуется отделить их от нейтральных Сахаров методом ионообменной хроматографии,,, как это описано в следующей методике.

Реактивы и оборудование

Реактив Моргана—Элсона 16 г л-диметиламинобензальдегидаз растворяют в достаточном количестве уксусной кислоты для получения конечного объема 95 мл. Добавляют 5 мл концентрированной НС1. Разбавляют уксусной кислотой в соотношении 1 : 5 для получения окрашивающего реактива. (Предостережение! Необходимо работать в вытяжном шкафу во избежание вдыхания паров соляной и уксусной кислот. Во время приготовления и применения реактива следует надевать защитные перчатки, одежду и очки )

3 н. НС1.

3 и. NaOH.

Насыщенный раствор бикарбоната натрия К 100 мл дистиллированной воды добавляют —15 г NaHC03 и перемешивают в течение 15 мии при комнатной температуре.

5%-ный (объем/объем) уксусный ангидрид в дистиллированной воде готовят непосредственно перед применением и держат во льду. {Предостережение! Во избежание попадания жидкости или паровз на кожу и в глаза необходимо работать в вытяжном шкафу. Нельзя насасывать раствор в пипетку ртом.)

5%-ный раствор К2В4О7 в дистиллированной воде.

Стандартный раствор глюкозамина: 17,92 мг глюкозамина растворяют в 10 мл 3 и НС1. Основной раствор хранят в холодильнике* Еженедельно готовят свежий раствор. Стандартный основной раствор содержит 0,2 мкмоля глюкозамина в 20 мкл. Раствор разбавляют 3 н. НС1 для получения стандартных растворов, содержащих от 0,01 до 0,2 мкмоля глюкозамина в 20 мкл.

Ампулы: 1-мл ампулы для лиофилизации или 1-мл пробирки,, имеющие завинчивающиеся крышки с тефлоновыми прокладками.

Пирексовые пробирки на 3 мл.

Спектрофотометр или колориметр.

Стеклянные кюветы на 1 мл.

Методика

Лиофилизуют одну или несколько проб, содержащих от 0,01 до 0,1 мкмоля гексозамина. В каждую пробу добавляют по 20 мкл 3 н. НО. Готовят стандартные растворы глюкозамина (0,01—0,2 мкмоля на 20 мкл 3 н. НС1). Пробы и стандартные растворы нагревают при 95 °С в течение 4 ч. в запаянных ампулах или пробирках. Гидролизаты охлаждают и нейтрализуют добавлением 20 мкл 3 н. NaOH. В 3-мл пробирки переносят па1 30 мкл каждого гидролизата. Добавляют по 10 мкл насыщенного раствора NaHC03 и по 10 мкл свежеприготовленного 5%-ного уксусного ангидрида. Пробирки оставляют на 10 мин при комнатной температуре; в это время происходит N-ацетилирование гексозаминов. Затем пробирки погружают в кипящую воду ровно на 3 мин для разрушения непрореагировавшего уксусного ангидрида. Добавляют 50 мкл 5%-ного раствора К2В4О7, перемешивают и нагревают в кипящей бане в течение 7 мин. Охлаждают и добавляют 0,7 мл окрашивающего реактива (разбавленный в соотношении 1 :5 реактив Моргана—Элсона). Смесь снова перемешивают и инкубируют при 37 °С в течение 20 мин. Измеряют поглощение пробы в каждой пробирке при 585 нм в 1-мл стеклянных кюветах (разд. 16.1.1).

Суммарное содержание гексозаминов в каждой пробе определяют по стандартной калибровочной кривой,, отражающей зависимость между оптической плотностью при 585 нм и количеством гексозамина в стандартных растворах (разд. 16.1.1). Глюкозамин, галактозамин и мурамовая кислота имеют одинаковый коэффициент молярной экстинкции.

Применение методики

Как упоминалось выше, эта методика непригодна для идентификации гексозаминов в сложных смесях Сахаров и их производных. Производные гексозамина, такие, как N-ацетилмурамовая кислота, связанная с пептидами (которые могут отщепляться под действием лизоцима), образуют одинаковые окрашенные продукты.

Решающее значение в реакции имеет степень нейтрализации НС1 после гидролиза пробы, которая должна быть абсолютной. Поэтому важно тщательно готовить растворы НС1 и NaOH и хорошо запаивать ампулы или закрывать пробирки перед гидролизом образцов.

Количественное определение глюкозамина, галактоза-мина и мурамовой кислоты по отдельности можно проводить с помощью методики, описанной Стьюартом-Тул-лом [15]. Другие тесты на мурамовую кислоту приведены в разд. 17.2.8.

17.2.7. Гексозамины в сложных растворах

Гексозамины в сложных растворах, а также образующиеся при гидролизе смешанных полимеров можно отделить от нейтральных Сахаров, мешающих определению в реакции Моргана — Элсона, с помощью ионообменной хроматографии. После очистки гексозамины количественно анализируют по описанной выше модифицированной методике Моргана — Элсона.

Реактивы и оборудование

4 и НС1.

1 н. NaOH.

Ампулы для лиофилизации или пирексовые пробирки, имеющие завинчивающиеся крышки с тефлоновыми прокладками.

Колонки с дауэксом-50 (Н+). Ионообменную смолу дауэкс-50 добавляют (по 1 г на каждую анализируемую пробу) к 2 и. NaOH ^20 мл/г смолы). Перемешивают 5—10 мин и фильтруют через воронку Бюхнера. Смолу промывают дистиллированной водой (50 мл/г) « медленно перемешивают с 3 н. НС1 (20 мл/г). Удаляют НС1 фильтрованием через воронку Бюхнера и промывают смолу на фильтре 2—5 л дистиллированной воды для удаления кислоты. Удаляют воду путем отсасывания и суспендируют смолы в дистиллированной ©оде (1 г/5 мл). 5 мл суспендированной смолы набирают в пастеровскую пипетку или 3-мл шприц с иглой № 18, у основания которого помещен тампои из стекловаты. К пипетке или шприцу присоединяют резиновую трубку с зажимом на конце для регулирования потока вытекающего раствора. Необходимо следить, чтобы уровень жидкости не опускался ниже уровня смолы.

Вакуумный эксикатор с гранулами NaOH.

Воронка с мелкопористым стеклянным фильтром.

Воронка Бюхнера.

Методика

Пробу, анализируемую на гексозамины, перемешивают с 4 н. НС1 в маленькой ампуле для лиофилизации. Количество материала и кислоты зависит от того, какой материал используется. Пробы должны содержать 50— 100 мг (сухого веса) бактериальных клеток или немного меньше очищенного материала в 3 мл 4 н. НС1. В каждой пробе должно быть 150—500 г гексозамина в 3 мл. Препарат гидролизуют б ч при 100 °С в запаянной ампуле, через которую предварительно пропускали азот.

Оптимальное время гидролиза выбирают исходя из предварительных опытов, в которых пробы обрабатывают НС1 в течение различных периодов времени. Вначале количество гексозаминов увеличивается до максимума, а затем уменьшается в результате разрушения. Поправку на потери можно сделать добавлением в одну из проб известного количества гексозамина i[17].

Сначала гидролизат высушивают в вакууме над NaOH для удаления НС1, а затем в эксикаторе над гранулированным NaOH. Добавляют воду и снова высушивают. Растворяют гидролизат в воде и пропускают через воронку с пори