именяемой для водных растворителей, или же после высушивания под лампой накаливания в сцинтилляционной смеси на основе толуола (разд. 16.4.3).

17.1.4. Липиды

1. Чтобы выделить липиды из осажденной в центрифужной пробирке фракции макромолекул, осадок суспендируют в 10 мл охлажденной 10%-ной ТХУ во встря-хивателе Vortex. (Предостережение! Во время суспенди-рования пробирку следует закрывать во избежание разбрызгивания аэрозолей ТХУ и радиоизотопов.)

2. 1 мл гомогенной суспензии фильтруют и фильтр дважды промывают 2 мл охлажденной 10%-ной ТХУ. Затем для удаления остатков ТХУ, которая может вызывать солюбилизацию части белка на следующем этапе, фильтр промывают 3 мл охлажденного 70%-ного этанола. Фильтрат выливают,

3. Колбу с фильтром и пробирку для сбора фильтрата помещают в термостат при 45 °С. После нагревания до 45 °С колбу вынимают из термостата, быстро наносят на фильтр 10 мл 70%-ного этанола (нагретого до 45°С в водяной бане) и ждут, пока растворитель медленно пройдет через фильтр. Фильтрат собирают в пробирку.

Для того чтобы прошла экстракция, фильтрование должно длиться ~ 10 мин.

4. Фильтр промывают в вытяжном шкафу 2—5 мл смеси этанола и диэтилового эфира (1:1, объем/объем), нагретой до 45 °С в водяной бане, медленно пропуская растворитель через фильтр (в течение 10 мин). Фильтрат собирают в пробирку и объединяют с нагретым до 45 °С этанолом, использовавшимся для промывания на этапе 3. Фильтр с остатками осажденной фракции макромолекул сохраняют для дальнейшего фракционирования.

5. Объем объединенных фильтратов доводят до 25 мл, образец высушивают в сцинтилляционном флаконе под струей профильтрованного воздуха при 40 °С. Воздух фильтруют, пропуская его под давлением через стекловату.

6. Определяют радиоактивность высушенного образца липидов в сцинтилляционной смеси на основе толуола (разд. 16.4.3).

17.1.5. Рибонуклеиновые кислоты

1. После удаления липидов из осажденной фракции макромолекул можно выделить РНК. Фильтр с осадком вынимают из держателя (см. выше этап 4), помещают в 20-мл химический стакан и высушивают в течение 10 мин на воздухе в вытяжном шкафу.

2. В стакан на фильтр наносят 2 мл 0,5 н. NaOH (подогретого до 37 °С) и инкубируют, изредка встряхивая, при 37 °С в течение ровно 40 мин. Важно, чтобы фильтр был полностью покрыт раствором NaOH. Более продолжительная инкубация может привести к гидролизу некоторых белков [1, 3].

3. Стакан переносят в лед и быстро охлаждают. Добавляют 0,6 мл охлажденной 50%-ной ТХУ, перемешивают и оставляют во льду приблизительно на 30 мин.

4. Раствор переносят из стакана на новый фильтр, укрепленный на держателе, фильтруют под вакуумом и собирают кислоторастворимые вещества в пробирку. К первому фильтру в стакан наливают 3 мл холодной 5%-ной ТХУ, переносят этот раствор на второй фильтр и собирают фильтрат в ту же пробирку, где уже находится первый фильтрат. Объединенный фильтрат разбавляют в мерной колбе до 15 мл дистиллированной водой. Этот фильтрат содержит около 95% рибонуклеоти-дов РНК5. Определяют радиоактивность гидролизованной фракции РНК так же, как радиоактивность низкомолекулярной фракции (см. выше и разд. 16.4.3).

17.1.6. Дезоксирибонуклеиновая кислота

1. После удаления липидов и РНК из макромолеку-лярной фракции ДНК выделяют из осажденной фракции макромолекул на фильтре, обрабатывая его горячей ТХУ. В эксперименте используют второй образец, который получают после суспендирования осадка в холодной ТХУ, как описано для первых этапов фракционирования липидов (разд. 17.1.4). Повторяют этапы 1—4 по удалению липидов. После промывания фильтра этанолом и смесью этанола и эфира для удаления липидов фильтр помещают в химический стакан, добавляют 2 мл 0,5 н. NaOH, перемешивают и инкубируют в течение 90 мин при 37 °С. Период инкубации с NaOH увеличивают для того, чтобы прошел полный гидролиз РНК. ДНК присутствует в меньших количествах, чем РНК* и поэтому следы негидролизованной РНК могут завышать оценку радиоактивности ДНК. Солюбилизация некоторых белков не влияет на результат определения радиоактивности ДНК.

2. Стакан с фильтром охлаждают во льду, добавляют 0,6 мл охлажденной 50%-ной (вес/объем) ТХУ и оставляют во льду на 30 мин. Затем раствор из стакана выливают на новый фильтр, предварительно замоченный в охлажденной 5%-ной ТХУ. Фильтруют под вакуумом. Первый фильтр дважды промывают 3 мл охлажденной 5%-ной ТХУ и фильтрат выливают.

3. Оба фильтра помещают в 10-мл колбу Эрленмейе-ра, добавляют 3 мл 5%-ной ТХУ и нагревают 30 мин на водяной бане при 80 °С. Фильтры при этом должны быть полностью погружены в жидкость.

4. Добавляют 0,1 мл раствора бычьего сывороточного альбумина (1,0 мг/мл), быстро перемешивают, охлаждают колбу 30 мин в ледяной бане и фильтруют содержащийся в ней раствор через новый фильтр. Добавлением бычьего сывороточного альбумина обеспечивается более полное осаждение высокомолекулярных веществ, которые в противном случае могут остаться в суспензии. Для ускорения фильтрации применяют слабый вакуум. Фильтрат собирают в пробирку, помещенную в колбу. Колбу Эрленмейера и фильтры дважды промывают 3 мл охлажденной 5%-ной ТХУ. Фильтраты собирают в ту же пробирку. Объединенный фильтрат разбавляют водой до 15 мл в мерной колбе, а фильтры выбрасывают.

5. Радиоактивность фракции гидролизованной ДНК определяют так же, как в случае низкомолекулярной фракции (см. выше и разд. 16.4.3).

17.1.7. Белки

1. Для выделения белков из осажденной фракции макромолекул используют второй образец осадка, суспендированного в охлажденной ТХУ, как описано в 1-м этапе фракционирования липидов. 1 мл образца вносят в пробирку 15X100 мм и разбавляют 1 мл воды до 5%-ной (вес/объем) концентрации ТХУ.

2. Разбавленную пробу нагревают 30 мин при 80 °С для гидролиза РНК и ДНК.

3. Гидролизованную пробу охлаждают во льду в течение 30 мин для осаждения белков. Осадок собирают на фильтре, фильтрат выбрасывают. Пробирку дважды споласкивают 2 мл охлажденной 10%-ной ТХУ и 1 раз 3 мл охлажденного 70%-ного этанола и наносят эти растворы на фильтр для удаления остатков ТХУ, которая в противном случае приведет к солюбилизации некоторой части белка на следующем этапе.

4. Фильтр дважды промывают 5 мл 70%-ного этанола (45 °С) и дважды 5 мл смеси этанол — диэтиловый эфир при 45 °С.

5. Фильтр высушивают на воздухе, помещают в сцин-тилляционный флакон и сушат под лампой накаливания.

6. Определяют радиоактивность высушенного на «фильтре белка в сцинтилляционной смеси на основе толуола (разд. 16,4,3).

17.1.8. Применение методов фракционирования

Описанные выше методики обычно применяют для фракционирования бактериальных клеток, меченных одним из компонентов среды, который неспецифически включается во все молекулы клеток. При инкубировании бактериальных клеток в присутствии специфического предшественника макромолекулярного вещества для измерения скорости его синтеза важно определить, что данное вещество содержит всю радиоактивность. Это делают путем фракционирования клеток и подсчета радиоактивности каждой фракции по описанным выше методикам. Если в изучаемой фракции содержится вся радиоактивность, то дальнейшие эксперименты можно упростить. Например, если для определения количества синтезируемой ДНК применяется радиоактивный тими-дин и в предварительных опытах показано, что он не включается в другие фракции, то клетки в культураль-ной среде обрабатывают следующим образом. Среду охлаждают и добавляют к ней охлажденную 10%-нуЮ' ТХУ. Осадок, содержащий ДНК, собирают на фильтре,, промывают охлажденным этанолом, высушивают и подсчитывают в нем радиоактивность. Эта методика применима для определения количества синтезируемой ДНКГ а также белка или РНК, если предшественник последних обнаруживается только в одной фракции.

При определении скорости синтеза различных веществ учитывают и другие факторы. Прежде всего это разбавление добавляемых извне субстратов немечеными предшественниками, имеющимися в клеточных пулах. В кинетических экспериментах необходимо определить скорость насыщения пула радиоактивными предшественниками. В описанных выше методиках при использовании для оценки распределения радиоактивности 14С-соединений некоторые клеточные компоненты не учитываются. Например, во фракции РНК оказываются продукты гидролиза тейхоевых кислот и полифосфатов, а вместе с белком осаждается пептидогликан.

Поли-р-гидроксибутират, если он присутствует, можно экстрагировать смесью хлороформ—метанол (2:1, сбъем/объем) при 60 °С после промывания смесью эфир—этанол. В случае применения указанных растворителей фильтры должны быть устойчивы к метанолу и хлороформу, а экстракцию следует проводить в вытяжном шкафу (разд. 17.3.1).

Полисахариды частично экстрагируются охлажденной ТХУ и могут существенно влиять на оценку радиоактивности низкомолекулярных веществ. Большие количества полисахаридов создают серьезные трудности при применении неспецифических предшественников, таких, как радиоактивная глюкоза. В этом случае применяют модифицированные методики [3].

У некоторых бактериальных клеток пулы низкомолекулярных веществ частично утрачиваются во время центрифугирования и промывания. Ряд бактерий обладает высокой нуклеазной или протеолитической активностью, которая может во время их сбора или промывания еще больше возрастать.

Если на первых этапах брать меньшие количества исходного материала, чем указано в методике, происходят значительные потери высокомолекулярных веществ. Чтобы улучшить осаждение макромолекул, в качестве носителя можно добавлять немеченые бактериальные клетки. ДНК и белок лучше осаждаются при добавлении к растворам сывороточного альбумина.

Фракционирование каждого нового микроорганизма потенциально представляет собой проблему. Хотя описанные здесь методики широко применяются на практике, при интерпретации результатов каждый раз следует проверять, достигнуто ли полное разделение низко-и высокомолекулярных веществ [3].

Другие методы обработки образцов описаны в работах [2, 3]. Однако при их применении вероятность перекрестного загрязнения фракций выше, чем