Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

м подращивании культуры, подвергнутой действию мутагена, перед высевом на селективную среду.

Одна из основных трудностей при прямом отборе состоит в выборе оптимальной концентрации селективного агента. Например, при отборе мутантов, устойчивых к различным антибиотикам, важно подобрать такую концентрацию антибиотика, которая полностью блокировала бы рост бактерий дикого типа, но в то же время позволяла бы развиваться устойчивым мутантам. Определение оптимальной концентрации методом проб п ошибок может потребовать много времени и сил. В первом примере, приведенном ниже, описан простой метод создания градиента концентрации какого-либо агента в чашке, который можно модифицировать для выявления различных типов мутантов, упоминавшихся выше. Во втором примере описывается простой метод бумажных дисков, используемый для индукции и прямого отбора ревертантов ауксотрофных мутантов.

13.5.1. Устойчивость к антибиотикам

Мутанты, устойчивые к антибиотикам, выделить довольно легко, а сами значения устойчивости могут служить удобными генетическими маркерами, характеризующими бактериальный штамм. В данном примере описывается метод получения спонтанно возникающих мутантов [24].

Приготовление градиентного агара в чашках

1. В стерильные чашки Петри диаметром 100 мм наливают по 10 мл автоклавированного питательного агара (разд. 13.9.12) и оставляют его остывать при таком

наклоне чашек, чтобы получался скошенный агар

(рис. 13.1).

2. После того как агар застывает, чашки ставят горизонтально и наливают в каждую еще по 10 мл агара

с одним из антибиотиков (разд. 13.9.14): сульфатом

стрептомицина (100 мкг/мл), пенициллином (500 мкг/мл)

или рифампином (50 мкг/мл).

В результате получается градиент концентрации антибиотика, возрастающий от низких значений у левого края чашки до высоких значений у правого края.

3. Агару второго слоя дают возможность остыть на горизонтально выставленном столике. В результате формируется градиент концентрации антибиотика от О мкг/мл на одном из краев чашки до максимальной концентрации (50—500 мкг/мл) на противоположном.

4. Отмечают края с указанием направления градиента. Чашки с агаром готовят не позднее чем за 24 ч до использования, чтобы успел сформироваться градиент концентрации антибиотика.

Метод выделения мутанта

1. Выращивают культуру интересующего прототроф-ного штамма, выделенного из отдельной колонии, до середины логарифмической фазы роста в L-бульоне (разд. 13.9.1) или питательном бульоне (разд. 13.9.11).

2. Равномерно распределяют образцы культуры объемом 0,1 мл каждый по поверхности агара в чашках с градиентами антибиотика (разд. 13.9.14).

3. Инкубируют чашки в течение 24—36 ч.

4. Отбирают устойчивые к антибиотику колонии стерильной петлей и высевают штрихом на вторую градиентную чашку в направлении возрастания концентрации антибиотика с целью определить их приблизительный уровень устойчивости.

5. После второй инкубации отбирают отдельные колонии и испытывают в чашках с тем или иным антибиотиком в отсутствие градиента (разд. 13.9.14). Антибиотики добавляют в разной концентрации, чтобы по полученным результатам можно было оценить устойчивость к ним бактерий. В том случае, если нужна высокая степень устойчивости к антибиотику, штаммы, полученные после первого цикла отбора, можно вновь нанести в чашки с агаром, имеющим в 5—10 раз более крутой градиент концентрации антибиотика, и затем провести процедуры, как описано выше.

13.5.2. Анализ обратных мутаций

(метод бумажных дисков)

Прямой отбор широко используется для получения ревертантов (бактерий с обратными мутациями) ауксотрофных мутантов. Ауксотрофы представляют особый класс условно летальных мутантов, не способных выживать без искусственной поддержки извне в виде добавления какого-нибудь соединения — участника обмена веществ (например, аминокислоты, витамина), которое они сами не в состоянии синтезировать. Если ауксотроф возник в результате мутации, связанной с заменой оснований, его можно «ревертировать» (вызвать обратную мутацию, возвращающую к исходному типу) воздействием соответствующего мутагена. Помимо «истинных ревертантов» может возникать множество «фенотипических ревертантов», которые своим появлением обязаны мутациям в локусах, отличных от тех, которые ответственны за первоначальную мутацию Например, мутанты со сдвигом рамки часто могут ревертировать за счет вторичной компенсаторной мутации со сдвигом рамки, расположенной вблизи локуса первой мутации и восстанавливающей правильное считывание триплетов. Некоторые мутанты с заменой оснований могут ревертировать под действием вторичной мутации, происходящей в другом месте мутировавшего гена. Предполагается, что при этом вторичная мутация частично компенсирует первоначальную мутацию посредством взаимодействия аминокислот, кодируемых мутировавшими локусами гена и расположенных в двух измененных областях белковой молекулы. Мутанты с заменой оснований, в особенности нонсенс-мутанты, могут также «ревертировать» за счет супрессорных мутаций в различных генах, кодирующих синтез тРНК. Благодаря этим супрессорным мутациям становится возможной трансляция измененной молекулой тРНК бессмысленного кодона в гене, кодирующем белок. Этим, хотя бы частично, исправляется первоначальная мутация. Во всех этих случаях «ревертанты» можно получить прямым отбором, просто высевая большое количество исходного мутантного штамма на среду без того метаболита, в котором данный штамм нуждается. Помимо очень большой чувствительности этого метода, который позволяет выявлять единственную бактерию с обратной мутацией на 108—109 мутантных клеток, подобного рода анализ предоставляет значительную информацию о природе исходной мутации. Сравнивая эффективности, с которыми различные мутагены обращают какую-либо мутацию, часто можно судить о том, что лежит в ее основе — транзиция или трансверсия, вставка или делеция оснований (сдвиг рамки). Способность мутации обращаться под действием любого мутагена считается свидетельством того, что эта мутация точко-вая, а не результат делеции, инверсии или другого типа хромосомных аберраций.

Методика, приводимая ниже, предназначена для выявления роста частоты обратных мутаций под действием нескольких часто используемых химических мутагенов. Эта методика с использованием дисков из фильтровальной бумаги, пропитанных соответствующими веществами [6, 9], позволяет исследовать на мутагенную активность не только аналоги оснований и гидроксиламин, но и алкилирующие агенты (ЭМС), соединения группы ICR (ICR-191), вызывающие преимущественно вставки и делеции пар оснований (сдвиги рамки), и НТГ, сходный по специфичности с ЭМС.

На практике отбирают несколько ауксотрофных штаммов интересующей исследователя бактерии, например штаммов, нуждающихся для своего роста в определенных аминокислотах. Обычно используют серию мутантов, выделенных после обработки различными мутагенами, и сравнивают их способность к реверсии.

Методика

1. Выращивают культуру каждого из исследуемых ауксотрофных штаммов до поздней логарифмической фазы роста (с концентрацией около 109 клетка/мл) в 5 мл L-бульона (разд. 13.9.1) или питательного бульона (разд. 13.9.11) при 37 °С.

2. Среду центрифугируют и клетки ресуспендируют в равном объеме минимальной среды М56 (разд. 13.9.8) или минимального бульона Дэвиса (разд. 13.9.15).

3. Наносят аликвоты получившихся суспензий на минимальный агар (разд. 13.9.10), разлитый достаточно толстым слоем (30 мл на чашку).

4. После того как поверхность подсохнет, стерильным пинцетом равномерно располагают на ней 6 дисков из фильтровальной бумаги диаметром 1 см.

5. Наносят на поверхность каждого диска каплю (приблизительно 50 мкл) одного из следующих растворов: стерильная вода (контроль), 5-бромурацил (8 мкг/мл), ICR-191 (1 мг/мл), НТГ (1 мг/мл), гидрок-силамин (17 мг/мл) и неразведенный ЭМС.

6. Инкубируют чашки в положении крышкой вверх в течение 4—5 сут при 37 °С, пока выросшие колонии не становятся легко различимыми. О вызванных мутагеном обратных мутациях можно судить по кольцам роста колоний вокруг дисков; непосредственно вблизи дисков колоний обычно не наблюдается из-за летального действия мутагенов. По полученной картине, зная преимущественную мутагенную специфичность взятых в опыт соединений, можно определить природу исходных мутаций.

Изучение свойств бактерий, претерпевших обратные мутации

Описываемый полуколичественный анализ может применяться для того, чтобы отличать полных ревертантов (имеющих первоначальный генотип и фенотип) и от частичных ревертантов, и от штаммов, содержащих не-сцепленные супрессоры. Два последних класса характеризуются сильно замедленным ростом в отсутствие добавки соответствующего питательного вещества. Из

Чашки, в которой ставилась проба с бумажными дисками, отбирают колонии разных размеров, наносят их штрихами на минимальный агар для очистки от посторонних мутантов, выращивают в питательном бульоне или делают посев соответствующих разведений на минимальный агар. После 2—3 сут инкубации при 37 °С определяют относительные размеры колоний. Частичные ревертанты и супрессированные штаммы, как правило, имеют колонии значительно меньших размеров.

В некоторых системах полные ревертанты можно отличить от двух других классов по чувствительности к тому или иному ингибитору обмена веществ, такому, например, как аналог, ингибирующий рост подавлением синтеза мРНК, кодирующей синтез ферментов. Так, для системы биосинтеза триптофана в качестве аналога, обладающего таким эффектом, может служить 5-метил-триптофан. При низких концентрациях этот ингибитор не тормозит синтез триптофана у полных ревертантов, однако практически полностью прекращает его в штаммах, которые синтезируют триптофан в ограниченных количествах. Чтобы показать это, наносят по 106—107 клеток исследуемых штаммов на минимальный агар в чашки (разд. 13.9.10 или 13.9.15). Так же как в случае пробы на обратные мутации, наносят каплю раствора 5-метилтриптофана (1 мкг/мл) на стерильный диск фильтровальной бумаги. Зона торможения роста вокруг диска бумаг

страница 5
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.06.2019)