,5% в 5%-ном растворе сахарозы) и проводят электрофорез в течение 30 мин для установления градиента. Затем образец в 10%-ном растворе сахарозы осторожно наслаивают на поверхность геля под амфолином. В трубку размерами 5X65 мм вносят от 30 до 300 мкг белка. Электрофокусирование проводят при постоянном напряжении 150 В и силе тока^ снижающейся от 5 до 0,5 мА.

Гели извлекают и окрашивают одним из принятых способов. Например, по методике Грэсслина и др. '[73], гели окрашивают при осторожном перемешивании в течение 30—60 мин в 0,2%-ном растворе кумасси яркого синего G-250 в смеси этанол — вода — ледяная уксусная кислота (45:50:5, объем/объем). Для обесцвечивания гелей их обрабатывают тремя порциями смеси этанол — вода — ледяная уксусная кислота (40:55:5) в течение 2 ч.

Чтобы измерить образовавшийся в геле градиент рН, столбик геля перед окрашиванием разрезают в продольном направлении. Полученные срезы разрезают на части в поперечном направлении. Каждый срез выдерживают в течение 1 ч в минимальном количестве воды, например в 0,5 мл или еще меньшем объеме, а затем в экстрактах определяют рН с помощью стеклянного микроэлектрода.

При разделении белков с очень большой молекулярной массой эффект молекулярного сита можно уменьшить, если использовать смесь 0,5%-ная агароза — 2%-ный полиакриламид [79]. В НЮАНИЙ электродный буфер добавляют раствор метилового красного (0,5 части на 1 млн.). Раствор окрашивается в желтый цвет при переходе в более щелочную область геля.

Гель для изоэлектрического фокусирования \69\ 4,5 части воды.

2 части раствора А (25 г акриламида и 1 г БИС на 100 мл воды).

0,5 частей раствора Б (1,0 мл ТЕМЭД на 100 мл воды). 2,5 частей раствора В (4 мг рибофлавина на 100 мл воды) 0,5 частей 40%-ного раствора амфолина

Верхний (анодный) электродный буфер представляет собой 5%-ный раствор фосфорной кислоты, а нижний (катодный) —5%-ный раствор этилендиамина.

16.5.4. Двумерное разделение

Хорошо известно, что при разделении белков с помощью диск-электрофореза в одной полосе не всегда -содержится только один белок, т. е. разделение сложных смесей может быть неполным. Наиболее эффективный подход предусматривает две стратегии разделения: на основе различий в размерах молекул и в значениях pi. Например, образец можно вначале подвергнуть изо-электрическому фокусированию в полиакриламидном геле. Затем гель извлекают из трубки или (если электрофорез проводился на пластине) вырезают узкую полоску геля. Эту полоску помещают у верхнего края новой пластины геля в том месте, где обычно делают канавки для образцов, и закрепляют ее растопленным агаром. Проводят второй этап разделения — гель-электрофорез в присутствии ДСН, после чего гель окрашивают. Пример особенно эффективного разделения белков этим методом описан О'Фарреллом [77], которому удалось обнаружить 1000 белков в экстракте клеток Escherichia coli.

16.6. МАНОМЕТРИЯ

Манометрическое измерение обмена газов между биологическими системами и окружающей средой в прошлом было основным средством изучения метаболизма. Во многих случаях манометрия и сейчас имеет преимущество перед другими методами, а иногда это единственно возможный способ исследования. Однако из-за сложности всей системы, связанной с манометрическими измерениями, а также благодаря появлению новых методов, таких, как определение концентрации ионов с помощью ионселективных электродов или газожидкостная хроматография, манометрия настолько утратила свою популярность, что ей угрожает полное забвение. Конечно, трудно наладить настоящее «преподавание» манометрии в современных лабораториях при постоянной нехватке времени. Поэтому исследователю приходится осваивать этот метод непосредственно в ходе проведения эксперимента. Поскольку манометрические методы позволяют осуществлять прямую и непрерывную регистрацию выделения или поглощения различных газов, таких, как кислород, водород, СОг, метан, а также ионы водорода, они находят широкое применение при исследовании гомогенатов тканей, клеточных и бактериальных суспензий и препаратов ферментов. Этот список можно дополнить косвенными методами, к которым относится, например, определение киназ на основе образования ионов водорода.

Основным источником информации в этой области и прекрасным руководством по многим аспектам метаболизма может служить книга Умбрейта и соавторов «Manometric Techniques^ [82].

16.7. ЛИТЕРАТУРА

Фотометрия

Общая литература

1. Bauman R. P. Absorption spectrophotometry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1962.

2. Brewer J. M., Pesce A. J., Ashworth R. B. Experimental techniques in biochemistry, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N. J., 1974. В гл. 7 рассмотрены теоретические аспекты адсорбции и флуоресцентного излучения.

Специальная литература

3. Burke R. W., Mavrodineonu R, Natl. Bur. Stand. Spec. Publ., 446 (1977).

4. Lucas D. H., Blank R. E. Am. Lab., 9(11), 77—89 (1977).

5. Slavin W. Anal. Chem., 35, 561—566 (1963).

6. Vanous R. D. Am. Lab., 10(7), 67—79 (1978).

7. West M. A., Kemp D. R. Am. Lab., 9(3), 37—49 (1977).

Ионные электроды

Общая литература

8. Buck R. P. Ion selective electrodes, Anal. Chem., 50, 17R—29R (1978).

9. Hitchman M. L. Measurement of dissolved oxygen, Chem. Anal. Ser. Monogr. Chem, 49, 1—255 (1978).

10. Long C. Biochemists handbook, p. 21. Van Nostrand Co., Princeton, N. J., 1961.

11. Westcott С. С. Biomedical рН measurements, Am. Lab., 10(3), 131—145 (1978).

12. Westcott С. С Selection and care of pH electrodes, Am. Lab., 10(8), 71—73 (1978).

Специальная литература

13. Estabrook R. W. Methods Enzymol., 10, 41—47 (1967).

14. LeBlanc P. J.t Silwinski J. F. Am. Lab., 5(7), 51—54 (1973).

15. Rechnltz G. A. Am. Lab., 6(2), 13—21 (1974).

16. Toth К-, Pungor E. Am. Lab., 8(6), 9—18 (1976).

Хроматография

Общая литература

17. Brewer J. M., Pesce A. J., Ashworth R. B. Experimental techniques in biochemistry, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N. J., 1974.

18. Determann H. Gel chromatography, Springer Verlag, New York, 1968.

19. Dunlap R. B. (ed.). Immobilized biochemical and affinity chromatography, Plenum Publishing Corp., New York, 1974.

20. Gelotte В., Porath J. In: E. Heftman (ed.), Chromatography, 2nd ed., p. 343—369, Reinhold Publishing Corp., New York, 1967.

21. Heftman E. Chromatography, Van Nostrand-Reinhold, New York, 1975.

22. Jakoby W. В., Welchek M. (ed.). Methods Enzymol., 34, 3—171 (1974),

23. Khym J. X. Ion exchange procedures in chemistry and biology: theory, equipment, technology. Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N. J., 1974.

24. Kirkland J. J. (ed.). Modern practice of liquid chromatography, Wiley Interscience, New York, 1971.

25. McNair H. M., Bonelli E. J. Basic chromatography, Varian Aerograph Co., Walnut Creek, Calif., 1967.

"26. Mitruka В, M. Gas chromatographic applications in microbiology and medicine, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1975. В книге уделено много внимания методам, применяемым в изучении микроорганизмов.

27. Pharmacia Fine Chemicals Sephadex. Gel filtration in theory and practice, Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden.

28. Whatman Inc. Liquid chromatography guide. Bulletin No. 123. Whatman Inc., Clifton, N. J., 1977.

Один из нескольких коммерческих источников информации, особенно, по хроматографическим средам.

Специальная литература

29. Alcock N. W. Methods Enzymol., 13, 397—415 (1969).

SO. Andrews P. Biochem. J., 91, 222—233 (1964).

31. Asteriadis G. Т., Armbruster M. A., Gilham P. T. Anal. Biochem., 70, 64—74 (1976).

32. Axen R., Porath J., Ernback S. Nature (London), 214, 1302—1304 (1967).

33. Blattner F. R., Erickson H. P. Anal. Biochem., 18, 220—227 (1967).

34. Brooks J. В., Dowell V. R.t Forsby D. S, Armfletd Л. R. Can. J. Microbiol., 16, 1071—1078 (1970).

35. Brooks J. B.t Moss С W., Dowell V. R. J. Bacteriol., 100, 528— 530 (1969).

36. Cuatrecasas P., Parikh I. Biochemistry, 11, 2291—2299 (1972).

37. Farshtchi D, Moss C. W. Appl. Microbiol., 17, 262—267 (1969).

38. Fuller A. I. Br. J. Exp. Pathol., 19, 130—139 (1938).

39. Fulmer C. S, Wasserman R. H., J. Biol. Chem., 254, 7208—7212 (1979).

40. Horii Z, Makita M., Tamura Y„ Chem. Ind. (London), 34, 1494 (1965).

41. Hummel /. P., Dreyer W. J., Biochim. Biophys. Acta, 63, 530—532 (1962).

42. Krishnan N., Krishna G., Anal. Biochem, 70, 18—31 (1976).

43. Laine R. A., Esselman W. J., Sweeley С. C, Methods Enzymol., 28, 159—178 (1972).

44. LaNoue K-, Nlcklas W. J., Williamson J. R.t J. Biol. Chem., 245, 102—111 (1970).

45. Levin O., Methods Enzymol, 5, 27—33 (1962).

46. Peterson E. A., Sober H. A., Methods Enzymol, 5, 3—27 (1962).

47. Reinhold V. JV., Methods Enzymol, 25, 244—249 (1972).

48. Sober H. Л, Gutter F. J., Wykoff M. M., Peterson E. A., J. Am. Chem. Soc, 78, 756—763 (1956).

49. Sweeley С. C, Wells W. W., Bentley R., Methods Enzymol, 8, 95— 108 (1966).

50. Whitaker J. R., Anal. Chem, 35, 1950—1953 (1963).

51. Yamakawa 7, Ueta N.t Jpn. J. Exp. Med, 34, 361—374 (1964).

Радиоактивность

Общая литература

52. Brewer J. M, Pesce A. /, Ainsworth R. B„ Experimental techniques

in biochemistry, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N. J, 1974.

В гл. 8 рассматриваются теоретические аспекты измерения радиоактивности

53. Horrocks D. D., Peng С.-Т. Organic scintillators and liquid scintillation counting, Academic Press Inc., New York, 1971.

54. Oldham K. G Radiochemical methods in enzyme assay, Amersham Searle Co, Arlington Heights, 111, 1976.

Специальная литература

55. Anderson L. E., McCture W. O. Anal. Biochem, 51, 173—179 (1973).

56. Anker H S FEBS Lett, 7, 293 (1970).

57. Bush E. T. Anal. Chem, 35, 1024—1029 (1963).

58. Fricke V. Anal. Biochem, 63, 555—558 (1975).

59. Jeffay H. Oxidation techniques for preparation of liquid scintillation samples. Packard Technical Bulletin 10, p. 1—8, Packard Instrument Co, Inc., Rockville, Md, 1962.

60. Jeffay Н., Alvarez J. Anal. Chem, 33, 612—615 (1961).

61. Patterson M. S.f Green R. C. Anal. Chem, 37, 85