Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

меньшей мере для четырех концентраций). Наклоны полученных прямых для исследуемых и стандартных белков откладывают против молекулярной массы каждого из них (рис. 16.12,Б). Молекулярную массу неизвестных белков определяют по калибровочному графику зависимости наклона — молекулярная масса.

Разделяющий 6%-ный гель, рН 7,9:

5 частей раствора А (трис-НС1, 0,48 М по О- плюс 0,46 мл. ^^Ы'^'-тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД) на 100 мл раствора, рН 7,9).

10 частей раствора Б (24 г акриламида и 0,8 г БИС на 100мл). 5 частей воды.

Необходимая для этой работы концентрация геля варьирует от 3 до 15%. Гели готовят, разбавляя концентрированный раствор Б до нужной концентрации (в приведенном выше примере до 6%). 3%-ный гель содержит 12 г акриламида и 0,4 г БИС на 100 мл раствора.

Концентрирующий гель, рН 5,7:

2 части раствора В (имидазол-НС1, 0,48 М по С1~, рН 5,7) 2 части раствора Д (4 мг рибофлавина иа 100 мл) 4 части раствора Г (10 г акриламида и 2,5 г БИС на 100 мл) 8 частей воды.

Растворитель для образца, рН 5,7:

Имидазол-НС1, 0,06 М по С1— в 50%-ном глицерине.

Электродный буфер:

0,034 М аспарагин и 5-10—5%-иый раствор бромтимолового синего, доведенный трисом до рН 7,3

Молекулярная масса денатурированных мономерных белков или субъединиц олигомерных белков

Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) позволяет снизить до минимума влияние зарядов белков на их подвижность, которая в этих условиях зависит только от размеров молекул. Под действием ДСН третичная и вторичная структуры белков разрушаются. Для определения молекулярной массы очищенных белков, а также мембран, рибосом и т. д. широко используется метод Вебера и Осборна [80]. ДСН высвобождает и солюбилизирует компоненты этих структур, которые невозможно растворить никаким иным способом. В этом методе используется только одна концентрация геля, и график зависимости относительной подвижности (отношение расстояния, пройденного фронтом красителя, к расстоянию, пройденному зоной белка) от логарифма молекулярной массы имеет линейный характер в довольно широком диапазоне значений молекулярных масс. Таким образом, молекулярную массу неизвестного белка можно определить по графику, построенному на основании данных для белков с известными молекулярными массами (рис. 16.12,Б). При данной концентрации геля, например 10%, график будет линейным в диапазоне молекулярных масс от 10 000 до 100 000 [71]. Для других концентраций геля этот диапазон может быть шире или уже.

Методика. Разделяющий гель, содержащий ДСН, приготавливают так, как это описано выше для электрофореза в неоднородной («прерывистой») системе. Однако в данном случае концентрирующий гель не используется и образец наслаивают непосредственно на поверхность разделяющего геля.

Растворы белков (0,2—0,6 мг/мл) инкубируют при 37 °С в течение 2 ч в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 1% ДСН и 1% ip-меркаптоэтанола. Для полного развертывания полипептидных цепей и диссоциации белковых субъединиц иногда необходимо прокипятить раствор, добавить к нему мочевину до концентрации 8 М и (или) восстановить и карбоксиметилиро-вать тиоловые группы [70]. Во многих случаях раствор можно использовать непосредственно без всякой обработки, но, если проведению электрофореза мешают соли, образец диализуют в течение нескольких часов при комнатной температуре против 500 мл 0,01 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 0,1% ДСН и 0,1% р-меркаптоэтанола.

Для приготовления образца смешивают в маленькой пробирке 3 мкл красителя (0,05%-ного раствора бром-тимолового синего), 1 каплю глицерина, 5 мкл [З-меркап-тоэтанола и 50 мкл раствора А (см. ниже). Затем добавляют 10—50 мкл раствора белка, смесь перемешивают и наносят на поверхность геля. Раствор А, разбавленный в соотношении 1 : 1, осторожно наслаивают на образец до самого верха пробирки. Электродные сосуды заполняют буфером раствора А, разбавленным в два раза. Используют трубки размерами 10 смХб мм |[80]. Электрофорез проводят при постоянном токе, причем сила тока составляет 8 мА на 1 трубку. Разделение продолжается в течение 4 ч. После электрофореза гели извлекают, окрашивают и измеряют, как обычно. Для отметки фронта растворителя используют медную проволоку № 32. Обычно на столбик геля наносят 10 мкг белка, но если краситель достаточно чувствителен для детектирования полосы, можно брать и меньшее количество белка. При нанесении на гель 100 мкг белка полоса имеет четкий передний фронт и размытый «хвост». Однако измерения в зоне переднего фронта дают хорошие результаты.

10%-ный разделяющий гель:

15 частей дезаэрированного раствора А (0,78 г NaH2P04-H20, 3,86 г Na2HP04-7H20 и 0,2 г ДСН на 100 мл).

13,5 частей раствора Б (22,2 г акриламида и 0,6 г БИС на 100 мл), отфильтрованного через бумагу Whatman № 1. Хранят в темной склянке при 4 °С. Для получения нужной степени сшивки используют разное количество БИС. После смешивания растворов А и Б смесь дезаэрируют.

1,5 частей свежеприготовленного раствора В (1,5 г персульфата аммония на 100 мл).

0,045 частей ТЕМЭД.

Молекулярная масса нуклеиновых кислот

Значение Rm (электрофоретической подвижности) для рибонуклеиновой кислоты с низкой молекулярной массой [76] и рибосомной рибонуклеиновой кислоты [75] обратно пропорционально коэффициенту седиментации. Следовательно, логарифм молекулярной массы обратно пропорционален величине электрофоретической подвижности [78]. Диапазон этой пропорциональности зависит от степени сшивки геля.

Методы фракционирования низкомолекулярных оли-годезоксирибонуклеотидов уже давно разработаны [72], тогда как определение молекулярных масс высокомолекулярных дезоксирибонуклеиновых кислот пока еще не применяется в повседневной работе.

Микрометод. Малые количества белков порядка нескольких микрограммов (10~6 г) или пикограммов (10—12 г) можно разделять в заполненных гелем капиллярных трубках различных размеров с помощью электрофореза в неоднородной («прерывистой») системе. Этот метод в основном сходен с описанным выше макрометодом, но для его применения необходим прибор, приспособленный для проведения всех операций (заполнение трубок гелем, электрофоретическое разделение, извлечение гелей из трубок и их анализ) в малых масштабах.

Препаративные методики. Описанный выше микрометод нельзя превратить в столь же эффективную препаративную методику путем одного лишь увеличения размеров колонки. Чтобы увеличить количество разделяемого материала, можно использовать большое число трубок малых размеров, но в этом случае разделение становится трудоемкой и длительной процедурой. При использовании для электрофореза больших колонок возникают проблемы, связанные с извлечением разделенных веществ из геля, с отводом выделяющегося тепла, с необходимостью удерживать слой геля в колонке и т. д. При конструировании приборов, выпускаемых промышленностью, делаются попытки так или иначе решить все эти проблемы. Кроме того, нужный компонент можно извлечь из геля, вырезав соответствующий участок геля и элюировав этот компонент путем диффузии или с помощью электрофореза. Еще один способ извлечения разделенных веществ заключается в том, что им дают выйти из геля, после чего они с непрерывным потоком буфера поступают в коллектор фракций. Приборы для препаративного электрофореза должны удовлетворять следующим требованиям. Необходимо, чтобы гель удерживался в колонке благодаря установлению гидростатического равновесия между верхним и нижним буферами; следует возможно более точно регулировать температуру с помощью циркулирующей системы охлаждения; важно, чтобы камера для элюирования имела небольшой объем. Описан целый ряд гелей и буферных систем, применяемых для препаративных целей

[66].

16.5.2. Иммуноэлектрофорез [65]

16.5.3. Изоэлектрическое фокусирование[63]

Изоэлектрическое фокусирование — это особый вид электрофореза, при котором происходит перемещение молекул через жидкостную колонку с постоянным градиентом рН. Амфотерные молекулы, например молекулы белка, изменяют свой заряд по мере того, как пересекают градиент рН и попадают в зону, где значение рН равно изоэлектрической точке (pi) данного белка. В этом положении молекула белка несет равное число отрицательных и положительных зарядов и поэтому больше не перемещается в электрическом поле. В этой зоне устанавливается равновесие между силами диффузии и электрофоретической подвижностью. Таким образом, при изоэлектрическом фокусировании разделение основано на различиях в значениях pi у разных белков. Для устранения конвекции колонку стабилизируют либо с помощью градиента плотности сахарозы, либо посредством сефадекса или полиакриламида. Колонку заполняют специальным имеющимся в продаже материалом (амфолином), который представляет собой смесь амфо-литов с различными значениями pi в определенном диапазоне. В электрическом поле молекулы амфолитов располагаются в соответствии с их изоэлектрическими точками и образуют стабильный градиент рН с высокой проводимостью и большой буферной емкостью. Введенная затем в колонку смесь белков распределяется по зонам, значения рН которых соответствуют изоэлектри-ческим точкам разделенных компонентов смеси. В продаже имеются амфолины с широкими и узкими диапазонами рН.

Изоэлектрическое фокусирование применяется как в препаративном, так и в аналитическом вариантах. Для аналитических целей используют методики, очень сходные с диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, при этом полиакриламид с низкой степенью сшивки служит в качестве антиконвекционной среды. Для препаративного разделения можно использовать готовое оборудование или изготовить его самим.

Аналитические методики

Описаны четыре системы для изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле [66]. Система Кастимпуласа [69] рассматривается в следующем разделе. Трубку заполняют гелеобразующим раствором и подвергают его фотополимеризации, как при диск-электрофорезе. Образец можно включить в состав полимери-зующейся системы, соответственно уменьшив объем добавляемой воды. Согласно другой методике, в трубку вносят слой амфолина (2

страница 48
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.08.2019)