Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

Б (10 г акриламида+2,5 г Ы.Ы'-метиленбис-акриламида (БИС) на 100 мл)

1 часть раствора В (4 мг рибофлавина иа 100 мл) 4 части раствора Г (40%-ный раствор сахарозы).

Разделяющий гель:

1 часть раствора Д (48 мл 1 н. НС1+36,6 г триса-Ь0,23 мл Ы,1Ч,1Ч',1\т'-тетраметилэтиленднамина (ТЕМЭД) на 100 мл)

2 части раствора Е (30 г акриламида + 0,8 г БИС на 100 мл) 1 часть воды

4 части раствора Ж (0,14 г персульфата аммония на 100 мл).

Использование персульфата для полимеризации позволяет получать гели с различной пористостью и элек-трофоретическими свойствами. Поэтому важно, чтобы полимеризация проходила при стандартных условиях. Персульфат может вызывать артефакты, которых легко избежать, если заменить персульфат рибофлавином и использовать фотолитическую полимеризацию вместо химической или применять восстанавливающие агенты, например тиогликолат (0,01—0,001 часть на 1 часть глицина в буфере). С той же целью можно добавлять мер-каптоэтанол (5 мМ) в концентрирующий и стартовый гели и в верхний буфер. Для удаления персульфата и других примесей иногда проводят предварительный электрофорез, но это нарушает прерывистость электро-форетической системы, превращая ее в однородную систему, что не всегда позволяет достичь нужного разрешения.

При электрофорезе белков в состав геля можно включать ряд диссоциирующих агентов, например додецил-сульфат натрия (см. ниже), дезоксихолат, тритон Х-100 и мочевину.

Электродные буферы

0,6 г триса, 2,28 г глицина, 2 мл 0,001 %-ного отфильтрованного раствора бромтимолового синего (только для верхнего буфера), рН 8,3.

В литературе описано много общих и специальных буферных систем, которые можно успешно использовать в качестве электродных буферов |[бб].

Чистота акриламида и БИС играет важную роль в достижении хороших результатов, особенно при сканировании в УФ-свете белков и нуклеиновых кислот (см. ниже). Реактивы высокой степени чистоты имеются в продаже, или их можно приготовить в лаборатории [66].

Проба

Проба должна по возможности иметь такой же состав буфера, рН и ионную силу, как и концентрирующий гель. Следует избегать применения растворов с высокой ионной силой.

Если при разделении получается небольшое количество полос, то вполне достаточно, чтобы проба содержала от 5 до 50 мкг белка на 1 гель; полоса, содержащая 1 мкг белка, хорошо видна после окрашивания кумасси ярким синим. Необходимо следить за тем, чтобы часть образца не перешла в электродный буфер.

Анализ гелей

Прямое денситометрическое определение. Анализируя результаты разделения белков и нуклеиновых кислот, часто упускают из вида возможность прямого сканирования гелей с помощью спектрофотометров. Этот метод отличается быстротой, позволяет проводить в процессе электрофореза повторное сканирование гелей через определенные промежутки времени для получения данных об электрофоретической подвижности исследуемых веществ и дает возможность избежать повреждения гелей при извлечении их из трубок. Недостатки метода заключаются в том, что его чувствительность (по отношению к белкам) в 2—3 раза ниже по сравнению с методом окрашивания, а также в том, что он требует применения пропускающих УФ-свет трубок, чистых реактивов и точной настройки оптической системы, предназначенной для сканирования круглых на поперечном срезе цилиндрических гелей. Недорогие пропускающие УФ-свет трубки легко изготовить, нарезав алмазной пилой обычные трубки типа «Vycor» (Corning Glass Works) с внутренним диаметром 5 мм на отрезки нужной длины. Отбирают трубки с одинаковыми оптическими характеристиками, рассматривая их на свет. Проблема оптической настройки для сканирования цилиндрических гелей одинакова в отношении как окрашенных* так и неокрашенных гелей. Существует несколько денситометров, обеспечивающих оптимальное сканирование таких гелей.

Анализ гелей после извлечения их из трубок. Извлеченные из трубок гели можно сканировать, не подвергая их никакой дальнейшей обработке или после окрашивания. Окрашенные гели можно также разрезать на сегменты и проанализировать материал, полученный путем элюирования. Кроме того, гели можно солюбили-зировать, например для определения в них радиоактивности. Гели извлекают из трубок и окрашивают сразу же после электрофореза во избежание диффузии полос. Извлечение гелей связано с трудностями, и для того, чтобы успешно провести эту процедуру, не повредив поверхности гелей, необходим определенный опыт. Один из возможных способов заключается в том, что в пространство между стенкой трубки и гелем медленно вводят вращательным движением иглу шприца длиной около 8 см, выдавливая из шприца воду или 50%-ный глицерин. Иглу вынимают после того, как гель начинает свободно перемещаться в трубке или когда его можно» вытеснить под давлением с помощью медицинской капельницы с грушей, заполненной водой. Это следует делать над лотком с водой или в самом лотке.

Окрашивание. В большинстве случаев перед анализом гели окрашивают. При разделении белков обычно применяют амидовый черный 10В, процион яркий синий RS и кумасси яркий синий R250 (последний обладает особенно большой чувствительностью). В продаже имеется много других красителей [66] для белков, дезокси-рибо- и рибонуклеиновых кислот. В литературе можно найти описание всевозможных вариантов окрашивания и различных усовершенствований. Сообщается, что про-цион яркий синий дает более воспроизводимые результаты, чем кумасси яркий синий, при количественном анализе гелей с помощью денситометра [66].

Для удаления из гелей додецилсульфата натрия, содержащегося в концентрации до 0,1%, гели перед окрашиванием промывают несколько раз смесью 10%-ной (вес/объем) трихлоруксусной кислоты и 33%-кого (объем/объем) водного раствора метанола.

Приготовление раствора красителя для белков. К 1 части 0,2%-ного водного раствора (вес/объем) кумасси яркого синего G250 добавляют 1 часть 2 н. H2S04 и оставляют на 3 ч. Осадок удаляют фильтрованием через хроматографическую бумагу Whatman № 1 и к раствору добавляют 7э объема 10 н. КОН. Затем приливают 100%-ную ТХУ до конечной концентрации 12% (вес/ /объем).

Гели помещают в раствор красителя на 5—8 ч. Окрашенные гели хранят в воде для достижения большей чувствительности. При хранении в кислотах интенсивность полос снижается. Этот метод позволяет получать линейные показания денситометра для белков (сывороточного альбумина) в интервале от 1 до 20 мкг.

Обесцвечивание. При окрашивании гелей по описанной выше методике фон остается прозрачным и не требует обесцвечивания. Однако во многих случаях после окрашивания необходимо проводить обесцвечивание фона. Это можно делать либо с помощью электрофореза, либо путем выщелачивания избытка красителя. Элект-рофоретическое обесцвечивание возможно в том случае, если краситель прочно связывается с белком, иначе некоторые полосы могут исчезнуть. Кроме того, для этих целей необходимо специальное приспособление. Тем не менее этот способ отличается быстротой и дает более светлый фон.

Для выщелачивания избытка красителя гели просто погружают на несколько часов в растворитель для красителя, обычно в уксусную кислоту.

Регистрация результатов и расчеты. Результаты разделения можно зарегистрировать самым простым способом, сделав схематические изображения окрашенных гелей. Более точные количественные измерения производят на основе: 1) фотографий окрашенных гелей и последующего денситометрического сканирования негатива; 2) оптического сканирования окрашенных или неокрашенных гелей (280 нм) с регистрацией оптической плотности по длине геля с помощью самописца; 3) элюи-рования и анализа небольших сегментов (толщиной 1 мм), полученных при разрезании цилиндрических гелей, или разжижения гелей и разделения их на фракции. Для выявления ферментов часто исполььуют следующую методику: сразу после электрофореза гель помещают в реакционную смесь, содержащую субстрат исследуемого фермента и какую-либо систему, обеспечивающую образование окрашенного продукта. После инкубирования геля в течение нескольких минут в нем появляется окрашенная зона, расположенная в том месте, где диффундирующие реагенты входят в контакт с ферментом. Если же реагенты не диффундируют в гель, то в результате реакции, происходящей на поверхности геля в зоне фермента, образуется кольцо.

Молекулярная масса нативных белков

Для определения молекулярной массы олигомерных белков широко применяется метод Хедрика и Смита [74], поскольку гель-электрофорез в присутствии доде-цилсульфата натрия (в том варианте, который описан ниже) обычно приводит к диссоциации таких белков на мономеры с конформацией статистического клубка. Чтобы применить этот метод к нативным белкам, необходимо построить график зависимости IgRm (логарифма отношения расстояния, на которое мигрировал данный белок, к расстоянию от старта до фронта красителя) от концентрации геля для каждого исследуемого и стандартного белка. С этой целью проводят электрофорез при нескольких концентрациях геля, т. е. при различной степени сшивки (рис. 16.12,Л), В результате получают ряд прямых с разными углами наклона. Зависимость тангенсов этих углов от молекулярных масс соответствующих белков также носит линейный характер. Для отражения этой зависимости строят второй график, используя стандартные белки с известными молекуляр

ными массами. Затем для неизвестного белка откладывают значения логарифма Rm против значений концентрации геля. По величине наклона полученной прямой на втором калибровочном графике находят молекулярную массу неизвестного белка.

Методика. Приготовление геля и электрофорез проводят в основном так, как описано выше в разделе, посвященном общим сведениям о гель-электрофорезе. Единственное различие состоит в том, что образец, разбавленный растворителем (см. ниже) в соотношении 1:1, осторожно наслаивают между концентрирующим гелем и буфером. После электрофореза фронт растворителя отмечают, вводя на этом уровне в столбик геля медную проволоку (№ 32). Гели окрашивают, как описано выше. Затем определяют значение Rm для каждого геля и строят график зависимости \gRm от концентрации геля (по

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2019)