Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

с различными размерами пор во время прохождения белков через три слоя геля. Концентрирование белков обеспечивают, подбирая буферные растворы, содержащие такую пару ионов и имеющие такие значения рН, чтобы подвижность одного иона (С1~), умноженная на степень его диссоциации, была больше произведения тех же величин для белка. В свою очередь это произведение должно быть больше, чем соответствующая величина для второго иона (глицина) |[66]. Для выполнения этих условий на более длинный разделяющий гель с мелкими порами наслаивают концентрирующий гель с низкой степенью сшивки. Поверх концентрирующего геля помещают крупнопористый стартовый гель, содержащий образец (рис. 16.10). Разделяющий гель готовят на более щелочном буфере с рН 8,9, тогда как концентрирующий и стартовый гели содержат буфер с рН 8,3. При наложении электрического поля белки быстро пересекают концентрирующий гель и образуют очень узкую полосу над разделяющим гелем, заключенную между хлорид- и гли-динат-ионами. Затем белки медленно проникают в разделяющий гель. Скорость их перемещения в разделяющем геле зависит от заряда (обусловленного рН) и размеров молекул (благодаря тому, что гель имеет поры с фиксированными размерами и определенную степень поперечной сшивки). Поскольку перед разделением белков они концентрируются в очень узкой зоне, достигается чрезвычайно высокое разрешение. Например, сыворотка крови разделяется на 15—20 зон. Сообщалось о разделении 62 компонентов сыворотки с помощью усовершенствованной системы для прерывистого электрофореза [81]. После окончания электрофореза гель можно анализировать путем сканирования в УФ-свете, не извлекая его из пробирки. Можно также проводить анализ с помощью УФ-сканирования или окрашивания после извлечения геля из пробирки. Согласно другому методу, гель разрезают на сегменты, которые затем вымачивают в растворе для элюирования содержащихся в них компонентов анализируемой смеси. Кроме того, при использовании меченых изотопов гели можно солюбилизиро-вать и определить в них радиоактивность. Можно также

Пространство над сепем ~ Гепь с образцом

Гель прокладка

рН6,7

Разделяющий гель ]}\\6Э -t

тт-т

Рис. 16.10. Слои геля и поведение ионов при диск-электрофорезе в по-лиакриламидном геле. Л. Образец в геле. Б. Образец, сконцентрированный иа границе раздела между гелем-прокладкой и разделяющим гелем. В. Образец, разделенный на полосы в конце процесса.

разрезать гель в продольном направлении и после вы-сушивания проанализировать его методом радиоавтографии.

Колоночный метод [66]

Для проведения электрофореза в колонках требуется очень простое оборудование, которое можно приобрести в готовом виде или изготовить в лаборатории. В него входит водонепроницаемый держатель для одной или более стеклянных трубок длиной 65—70 мм и внутренним диаметром 5 мм. Конструкция системы такова, что наверху находятся буфер и электрод (катод), контактирующие с трубкой, заполненной гелем, а внизу находятся такой же буфер и анод (рис. 16.11). Трубки должны быть одного диаметра и иметь ровные края. Такие трубки можно изготовить в лаборатории или стеклодувной мастерской. Они должны быть тщательно вымыты, перед сушкой их можно окунуть в неионный детергент (например, Kodak Photo-Flo).

Первоначальная процедура заполнения трубок ак-риламидом, описанная Орнстейном [67] и Дэвисом [64] , начиналась с полимеризации разделяющего геля в нижней части трубки. Позже была предложена методика |[66], по которой разделяющий гель полимеризуется в верхней части трубки, так как при этом образуется более однородная граница раздела между концентрирующим и разделяющим гелями. Заполнение трубки проводят следующим образом. В резиновый колпачок наливают 0,2 мл 40%-ного раствора сахарозы и плотно прижимают трубку к дну колпачка, для того чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Трубку устанавливают в вертикальное положение; затем готовят около 0,15 мл смеси для получения концентрирую^ щего геля (см. ниже) и с помощью небольшого шприца с иглой (длина 8 см, внутренний диаметр 0,6—0,8 мм) наслаивают эту смесь на раствор сахарозы. На поверхность концентрирующего геля осторожно наливают немного воды так, чтобы не произошло перемешивания этих двух слоев и между ними образовалась резкая граница. Высокое разрешение достигается в основном благодаря образованию четкой ровной границы между

птгг Q

концентрирующим и разделяющим гелями. Полимеризацию геля вызывают облучением его флуоресцентной лампой в течение 20—30 мин с расстояния 2—3 см. После полимеризации слой воды осторожно и тщательно удаляют шприцем, а затем тампоном из неворсистого материала.

Далее готовят разделяющий гель. Поверхность концентрирующего геля дважды быстро промывают смесью для получения разделяющего геля, а затем с помощью шприца заполняют трубку этой смесью так, чтобы получился выпуклый мениск, стараясь избежать образования пузырьков воздуха. Затем конец трубки плотно заклеивают полимерной пленкой. Всю эту процедуру необходимо провести в течение 5 мин после образования концентрирующего геля. Как только полимеризация закончится (через 30—40 мин), осторожно снимают колпачок, переворачивают трубку и аккуратно вставляют ее в резиновый колпачок нижним концом. Из другого конца, ставшего теперь верхним, удаляют раствор сахарозы и промывают поверхность концентрирующего геля смесью такого же состава. Затем наносят образец, включенный в смесь для приготовления стартового геля, и осторожно наливают электродный буфер до верхнего края трубки, не допуская перемешивания двух слоев.

После этого проводят фотолиз стартового геля, как описано выше. Всю эту процедуру можно легко провести сразу в нескольких трубках, если заранее приготовить все необходимые растворы и если флуоресцентная лампа имеет достаточную длину.

Трубки помещают в прибор и осторожно добавляют предварительно охлажденный электродный буфер в пространство сверху и снизу трубок (высота слоя нижнего буфера должна быть не меньше 4 см). Верхний буфер содержит бромтимоловый синий, для того чтобы можно было следить за перемещением границы. Затем подключают источник питания так, чтобы анод (положительный конец) был внизу. В течение первых 2 мин сила тока должна составлять 1 мА на 1 трубку, а затем 2— 5 мА на 1 трубку до тех пор, пока окрашенная полоса не окажется на расстоянии около 1 см от нижнего конца трубки.

При падении напряжения в процессе электрофореза выделяется тепло, пропорциональное силе тока. Избыточное тепло приводит к образованию неровных полос. Если в начале электрофореза температура системы была 20 °С, то через 40 мин она повышается до 30—40 °С. Температуру можно снизить, уменьшив силу тока, например, до 1 мА/гель при большей продолжительности электрофореза (140 мин). Однако в этом случае происходит некоторое расширение полос за счет диффузии. Можно также проводить электрофорез при 4°С, даже перемешивая при этом нижний электродный буфер.

Разделяющие гели можно хранить в течение нескольких дней, но после добавления концентрирующего геля и исследуемого образца в стартовом геле электрофорез следует начать не позже, чем через 1 ч. Электродные буферы можно использовать многократно, но анодный и катодный буферы необходимо хранить отдельно. После нескольких анализов или при изменении рН приготавливают свежие буферные растворы. Гели анализируют либо непосредственно в трубках, либо после извлечения из них.

Поскольку во время электрофореза проводимость геля изменяется, следует ожидать, что напряжение и ток также будут изменяться. Рекомендуется применять регулируемый источник тока, позволяющий поддерживать постоянную силу тока в течение всего процесса разделения.

Если число трубок с гелем, подвергаемых одновременному электрофорезу, равно л, то сила тока должна в п раз превышать ее значение, выбранное для одной трубки; при этом во всех трубках должна быть одинаковая сила тока. Это условие выполняется только в том случае, если площадь поперечного сечения и состав всех столбиков геля одинаковы.

Электрофорез на пластинах

Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах поли-акриламидного геля размерами 100X100 мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование. Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение; при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания или определения радиоактивности. Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных («прерывистых») буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения и анализа, что и при электрофорезе в трубках.

Приготовление гелей

Рассмотрим подробно приготовление одной из наиболее распространенных систем неоднородных («прерывистых») гелей. Описание многих других систем содержится в книге Мауэра [66]. Вследствие токсичности ак-риламида следует избегать вдыхания его распыленных частиц и попадания его на кожу.

Концентрирующий и стартовый гели:

1 часть раствора А (25,6 мл НзР04-т-5>7 г триса на 100 мл)

2 части раствора

страница 46
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2019)