Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

пользовании метода внутренней стандартизации. Применяя метод отношения каналов, образцы можно просчитывать повторно.

Метод внешней стандартизации. Новейшие приборы для измерения радиоактивности оснащены источником у-излучения с известной радиоактивностью, который в нужный момент в соответствии с программой работы прибора устанавливают прямо под флаконом. Счет производят с источником у-излучения и без него. Калибровочную кривую, отражающую зависимость счета для внешнего стандарта от эффективности счета (эффективность изменяют внесением тушителей), используют для коррекции счета в опытных образцах. Метод чувствителен к изменениям объема сцинтиллятора, толщины стеклянного флакона и природы сцинтиллятора. Ошибки могут возникать из-за негомогенности растворов или разного размера просчитываемых бумажных полосок. При низких уровнях радиоактивности длительный счет не требуется, как в методе отношения каналов. Метод внешней стандартизации можно усовершенствовать, если сочетать его применение с принципом определения отношения каналов. В этом случае внешний стандарт считают в двух каналах, отрегулировав порог на амплитуду импульсов, превышающую амплитуду импульсов исследуемого изотопа, а затем определяют эффективность счета. Этот метод требует наличия четырех каналов или двукратного счета при различных значениях порогов.

Сцинтилляционные растворы

1. Для измерения раиоактивности в неполярных растворителях (минимальная температура —30 °С):

2,5-Дифенилоксазол (РРО) 5 г/л

1,4-Бис-2- (5-фенилоксазолил) бензол

(РОРОР) 0,3 г/л

Толуол

Очень высокая эффективность счета (90—95%). Можно использовать для счета бумажных фильтров в форме дисков (Millipore Corp.), если они сухие Погруженные в толуол ди^и должны быть прозрачными; если они белые, то это означает, что высушивание было неполным.

2. Для измерения радиоактивности в гомогенных

растворах или эмульсиях (в зависимости от количества

воды: в присутствии 4—14%воды образуются растворы,

20—30% воды — эмульсии) [61, 62]:

Толуол (667 мл), содержащий 0,4% РРО (2,67 г) и 0,1% РОРОР (0,07 г)

Тритон Х-100 (Rohm and Haas Co., Philadelphia Pa.) 333 мл Эффективность счета для 14С — 52—68%, для 3Н —7—10%, однако она варьирует в зависимости от партии тритона Х-100.

3. Для измерения радиоактивности в устойчивых гелях с высоким содержанием воды [в присутствии ~35%

воды образуются эмульсии, при низкой температуре образуются устойчивые гели (до —5°С), которые при нагревании разжижаются] [61]:

Толуол (538 мл), содержащий 0,4% РРО (2,1 г) и 0,1% РОРОР (0,05 г)

Тритон Х-100 462 мл

Эффективность счета для ]4С — 43—55% в присутствии 43% воды. Использование трития рекомендуется только в том случае, если измеряют радиоактивность геля. Эффективность счета для 3Н равна —5°/о- Полезен при применении с суспензиями тканей, порошками, например карбонатом бария и другими материалами белого цвета.

4. Для измерения радиоактивности в гомогенных растворах с содержанием воды до 33% [58]:

Тритон Х-100 257 мл

Этиленгликоль 37 мл

Этанол 106 мл

Ксилол 500 мл (до конечного объема 1 л)

РРО 3 г (РОРОР ие используют)

Эффективность счета без тушения — 87% для 14С и 47% для 3Н. При максимальном количестве воды — 82% для 14С и 35% для 3Н. Зависимость между эффективностью счета и отношением внешнего стандарта (см. ниже) имеет линейный характер.

5. Для измерения радиоактивности в солюбилизированных полиакриламидных гелях:

Тритон Х-115 (Rohm and Haas Co.) 250 мл

Ксилол 750 мл

РРО 3 г (РОРОР не требуется)

Максимальная эффективность счета — 93% для 14С и 47% для 3Н. В присутствии 30% воды эффективность счета снижается до 50— 60% для иС и 10% Для 3Н. При промежуточных значениях концентрации воды образуется устойчивая эмульсия

6. Для измерения радиоактивности в С02 [60]:

Этаноламин 1 часть

Монометиловый эфир этиленгликоля 8 частей

Толуол 10 частей

РРО 5 г/л

16.4.4. Статистика счета [52, 53]

При определении радиоактивности по измерению счета и времени даже в идеальных условиях не исключены случайные ошибки, которые могут привести к неправильным результатам. Поэтому необходимо располагать статистическим способом определения ошибки. Для правильного его применения можно не знать, как получают конечные выражения, но необходимо знать принятые допущения и терминологию статистики счета. В нашу задачу не входит ни обсуждение применения этого способа, ни приведение соответствующих примеров, так как для этого потребовалось бы множество таблиц и графиков. Тем, кого интересует более подробная информация, мы рекомендуем обратиться к списку литературы в конце данной главы. Однако мы перечислим некоторые важные способы статистической обработки и приведем соответствующие уравнения. К ним относятся способы опре* деления среднего значения счета, стандартного отклонения для единичного и многократного счета, стандартной ошибки счета и скорости счета в процентах (% SE), а также времени счета, необходимого для получения результатов с данной стандартной ошибкой при наличии фона и без него с одинаковыми и различными временами счета фона и образца. Существуют также уравнения и таблицы для определения времени счета фона, а Также общего счета с определенной стандартной ошибкой. Эти уравнения и таблицы позволяют устанавливать пределы обнаружения радиоактивности и выбирать правильный способ устранения тех значений счета, которые сильно отклоняются от среднего.

Существуют различные виды ошибок: например, если истинное значение лежит в пределах измеренного в 50% случаев, то такую ошибку называют вероятной; если в 68% случаев, то ее называют стандартной (средней квадратичной) ошибкой, а если в99—100%, то 99%-ной. Поскольку коэффициент стандартной ошибки во многих статистических расчетах =1 и это значение используется чаще всего, мы рассмотрим здесь только «стандартные» формы уравнений. Это означает, что любое из ряда полученных значений не отличается от среднего значения более чем на стандартное отклонение в 32% случаев. Поскольку ошибки счета постоянны во времени, можно определить число просчитанных импульсов, необходимых для получения результатов с данной стандартной ошибкой, используя приведенные ниже выражения. Например, для стандартной ошибки в 1% требуется просчитать 10 000 имп, для 2,5% —1600, для 5%—400, а для 10% — 100. Как видно из выражений, представ-i ленных ниже, при стандартной ошибке 1% для счета фона потребуется 840 мин, а для счета образца и фона 1140 мин, тогда как при стандартной ошибке 10% эти цифры равны соответственно 8 и 11 мин.

Статистические формулы

1. Среднее значение для нескольких измерений:

jЈ Сумма импульсов отдельных измерений (X)

~~* Количество измерений (я)

2. Стандартное отклонение при нескольких циклах

измерений:

оп ((Сумма отклонений X от Х)2\^2

3. Стандартная ошибка скорости счета SE (%) равна

Скорость счета (Я)-Время (t)1^ '

4. Время, необходимое для получения результатов с данной стандартной ошибкой SE (%):

10*

/?(SE%)2 •

5. Стандартная ошибка счета образца, когда времена счета образца и фона одинаковы:

Ю0(ХсуММ-Хфон)1/2

ЬЬ(%)= 7Т~ ~у .

лсумм лфон

6. Стандартная ошибка счета образца без счета фона, когда времена счета фона и образца не одинаковы:

ЬЕ(/о) = —? БТ^ГЖ >

Rt-Rb

где Rt и Rb — суммарная скорость счета и скорость счета фона соответственно, a U и 1ъ — времена для Rt и

16.5. ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

16.5.1. Диск-электрофорез в геле

Диск-электрофорез в его многочисленных вариантах, позволяющий проводить разделение макромолекул, стал в настоящее время очень важным методом, применяемым в биологических и медицинских исследованиях, а также в клинической диагностике и промышленности (для контроля за технологическими процессами). С тех пор как в 1959 г. Орнстейн [67] и Дэвис [64] впервые описали метод «прерывистого» электрофореза, проводится широкое изучение всех аспектов гель-электрофореза, в результате чего был внесен большой вклад в разработку теории этого метода, получена подробная информация об условиях его применения на практике, а также описано множество систем буферов и гелей [66]. Здесь будет рассмотрена лишь одна из основных широко распространенных систем наряду с условиями ее использования, необходимыми для получения хороших результатов. Описаны также некоторые из главных областей применения диск-электрофореза.

Общие сведения

Электрофорез проводят либо в цилиндрических колонках, заполненных гелем (в стеклянных трубках), либо на пластинках размерами 10X10 см, покрытых слоем геля толщиной 1—4 мм. Гель состоит из трех слоев: внизу располагается разделяющий гель, в середине — концентрирующий (гель-прокладка) и вверху — стартовый гель, содержащий образец. Каждый слой представляет собой полиакриламид с определенной степенью сшивки. Гель образуется в трубке или на пластинке из раствора, содержащего акриламид (мономер), N.N'-ме-тиленбисакриламид (БИС), буфер, сшивающий и поли-мернзующий агенты. Полимеризацию катализируют либо химическим способом, используя персульфат аммония, либо фотохимическим — с помощью света, который вызывает образование свободных радикалов в присутствии кислорода.

Разделение белков в прерывистой системе зависит от двух основных факторов: 1) различий в подвижности белков, обусловленных присущим поперечно-сшитым гелям молекулярно-ситовым эффектом, обеспечивающим разделение молекул в соответствии с их размерами, и 2) различий, связанных с зарядом молекул. Кроме того, необычно четкие зоны образуются благодаря концентрированию белков в виде очень узкой полосы или диска перед вхождением их в разделяющий гель. Таким образом, величина молекулярно-ситового эффекта зависит от степени поперечной сшивки, которая в свою очередь определяется концентрацией сшивающего акриламида. Концентрирование белков в виде узкой полосы, перед тем как они входят в разделяющий гель, характерно для прерывистого электрофореза. Оно происходит в результате искусного использования неоднородного («прерывистого») ионного состава буферных растворов с разными значениями рН, а также неоднородных гелей

страница 45
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)