Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

существует, можно определить лишь относительную радиоактивность ряда образцов в одинаковых условиях. Вариабельность в счете уменьшается, если радиоактивное вещество полностью растворяется или совершенно не растворяется в сцинтилляцион-цом растворе. Например, для извлечения аминокислот и

Сахаров из бумаги используют гидроксид гиамина 10-Х в метаноле, а затем пробы просчитывают в толуоле. Если радиоактивное вещество нельзя полностью элюи-ровать с бумаги, можно сжечь ее и измерять радиоактивность С02 в составе органического основания или карбоната натрия (или бария). При просчитывании кусочка бумаги, содержащего нерастворимую радиоактивную фракцию, наиболее воспроизводимые результаты получают в том случае, когда он лежит на дне флакона.

Большие преимущества имеет использование дисков и полосок из стекловолокна, поскольку при этом повышается эффективность счета: с тритием она равна 10% при воспроизводимости ±5%, тогда как при использовании целлюлозных дисков она равна 2—8%. В случае более сильных источников излучения, например ,4С, воспроизводимость экспериментов и эффективность счета еще выше.

Полиакриламидные гели

Основной проблемой является быстрая солюбилмза-ция геля. Лучше всего гель солюбилизировать путем разрушения поперечных сшивок, поскольку несшитые линейные полиакриламидные цепи легко растворяются в сцинтилляционной смеси. В качестве поперечно-сшивающего агента обычно используют г^М'-диаллилтартар-диамид, который легко расщепляется йодной кислотой [56]. Ряд гелей, содержащих 7% (вес/объем) акрилами-да и 0,27% (вес/объем) поперечно-сшивающего агента, обрабатывают 0,5 мл 2%-ной йодной кислоты в течение 2 ч. Добавляют сцинтилляционную смесь, энергично перемешивают с помощью встряхивателя Vortex и используют для анализа весь раствор или отбирают из него аликвоты для счета. Сцинтилляционная смесь способствует растворению геля [55].

Двуокись углерода

Измерение радиоактивности 14С в составе СОг играет важную роль при изучении метаболизма бактерий, а также при проведении многих прикладных работ, где требуется сжигание или расщепление углеродсодержащих соединений. Для сцинтилляционного счета СО2 улавливают либо органическим основанием, например гидроксидом гиамина 10-Х, применом 81-R, этаноламин-этилендиамином или фенилэтиламином, либо гидроксидом бария или NaOH. Во всех этих случаях необходимы специальные емкости для основания. Основания с включенным СО2 вносят в сцинтилляционный раствор и просчитывают в счетчике. Способы сжигания описаны в работе Джеффи [59].

Работа с прибором

Регистрация одного изотопа. Прежде всего необходимо настроить прибор. Цель настройки — добиться максимальной эффективности счета для данного изотопа при минимуме фона. Для каждого канала возможны два типа настройки: 1) с помощью регулирования верхнего и нижнего порогов дискриминатора и 2) с помощью регулирования напряжения ФЭУ и коэффициента усиления. При увеличении последних двух параметров амплитуда импульса увеличивается.

С помощью верхнего и нижнего порогов дискриминатора устанавливают нужный диапазон амплитуды импульсов. Амплитудный спектр импульсов, или энергетический спектр, р-излучения определяют путем регулирования верхнего и нижнего порогов дискриминатора с последующей их фиксацией. Затем просчитывают изотоп при возрастающих значениях нижнего и верхнего порогов дискриминатора, но при постоянной разнице между ними (ширина окна) 0—10, 10—20, 20—30 и т. д. Кривая, отражающая счет в средней точке окна по всему диапазону дискриминатора, представляет собой энергетический спектр изотопа (рис. 16.8). Каждый изотоп имеет характерное распределение амплитуды импульсов. Очевидно, пороги в каждом канале можно отрегулировать таким образом, чтобы через него проходили импульсы из определенной части энергетического спектра изотопа, а импульсам из другой части спектра доступ был бы закрыт. Нижний порог устанавливают в положение, при котором исключалась бы большая часть шума, а верхний — в положение, при котором проходят импульсы с максимальной амплитудой. Благодаря такой

Рис. 16.9. Амплитудный спектр импульсов как функция напряжения ФЭУ. 1,2 — нижние пороги; 3, 4 — верхние пороги.

§

§

^5

настройке исключается большая часть шумов с низкой и высокой энергией.

Определяя амплитудный спектр импульсов при различных напряжениях фотоумножителя, получают совокупность кривых (рис. 16.9), с помощью которых определяют отдельно радиоактивность каждого из двух изотопов в одном образце. При понижении напряжения интервал регулировки порогов дискриминаторов становится более узким.

Во всех случаях следует определять фон, т. е. радиоактивность в сцинтилляционном флаконе с пробой, не содержащей радиоактивный изотоп, которую вычитают из результата счета для каждого образца. При большой скорости счета фон не имеет существенного значения, однако при малой его необходимо учитывать.

Счет двойных меток. Счет двух радиоактивных изотопов в смеси возможен, если они имеют различную энергию, благодаря чему разделяются их амплитудные спектры импульсов. Такими парами являются 3Н и 14С, 3Н и 36S, 3Н и 32Р, 14С и 32Р. Если изотоп с более высокой энергией подсчитывается исключительно в канале 1, то в канал 2 для изотопа с низкой энергией могут попадать и импульсы изотопа с высокой энергией. Поэтому необходимо измерить эффективность счета для каждого изотопа отдельно, лучше всего с помощью внутренних и внешних стандартов, а затем определить счет в канале 2 с помощью уравнений:

Расп /мин 14С = Расп /мин 3Н = (Счет в канале 2) —

Счет в канале 1 Эффективность счета 14С в канале 1

(Расп /мин 14С* Эффективность счета МС в канале 2)

Эффективность счета 3Н в канале 2

Эффективность счета в канале 2 для изотопа с низкой энергией (в данном случае 3Н) можно оптимизировать регулированием порогов дискриминатора, используя стандарт, содержащий тритий. Затем нижний порог канала 1 устанавливают таким образом, чтобы он исключал импульсы 3Н, а верхний — так, чтобы он обеспечивал максимальную эффективность счета 14С.

Применение этой методики целесообразно в том случае, если эффективность счета и тушение для образца соответствуют эффективности счета и тушению для используемого стандарта. При тушении большая часть импульсов с высокой энергией попадает в канал для низкой энергии. Исходное соотношение каналов, если оно известно по стандартам с подобным тушением, восстанавливают, изменяя положение порогов дискриминатора. Чтобы восстановить амплитудный спектр импульсов при исходной установке окна, можно также увеличить коэффициент усиления для ФЭУ или усилителя. Следует отметить, однако, что при низкой радиоактивности счет двойных меток сопряжен с трудностями и ошибками.

Эффективность счета и поправка на тушение. Даже лучшие сцинтилляционные счетчики в идеальных условиях не позволяют обнаружить все радиоактивные частицы, хотя для источников сильного р-излучения, например 14С и 32Р, достигается эффективность счета свыше 90%. Эффективность прибора можно определить несколькими способами с использованием неполярной сцинтилляционной жидкости, не содержащей химических и физических агентов, вызывающих тушение. Чаще всего эффективность прибора и поправку на тушение определяют с помощью одного из трех методов, описанных ниже, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

Метод внутренней стандартизации. Этот оригинальный метод относительно прост, надежен и точен при счете импульсов одной метки. Он требует поправки на тушение, обусловленное присутствием в смеси химических тушителей, в том числе окрашенных соединений. Сначала просчитывают рабочий образец (С), а затем к нему добавляют небольшое количество вещества с известной радиоактивностью (Ds) и той меткой, которую измеряют, например, для счета 14С добавляют 14С-бен-зойную кислоту, для счета 3Н — 3Н-толуол и т. д. и вновь просчитывают (Ct). Отсюда общая эффективность счета равна (Ct—C)/Ds, а радиоактивность образца равна

ь' сt-c ?

Метод внутренней стандартизации имеет ряд недостатков. Он довольно трудоемок, так как флаконы приходится извлекать из счетчика, добавлять в них стандарт и вновь просчитывать. После этого образец становится непригодным для повторного измерения. Метод также неудобен тем, что при добавлении стандарта во флакон необходима точная дозировка, которой достигают с помощью специальных автоматических пипеток или шприцев.

Метод отношения каналов. Этот метод основан на том, что амплитудный спектр импульсов в данной системе сцинтиллятор—изотоп при наличии тушения сдвигается. В счетчике с двумя каналами пороги в каждом регулируют раздельно, определяют счет в каждом канале и выражают его в виде отношения. Этот метод можно использовать и с одноканальным счетчиком, однако в этом случае необходимо производить счет дважды, перестраивая канал каждый раз по мере необходимости. Применяя стандарты с разным содержанием тушителя, строят кривую зависимости эффективности счета от отношения счета в каналах и затем используют эту кривую в последующих расчетах. В обоих каналах нижний порог устанавливают таким образом, чтобы фиксировались импульсы с амплитудой, превышающей амплитуду фоновых импульсов. Один из порогов — верхний или нижний — может быть одинаковым для обоих каналов, а второй — различным. Можно настроить счетчик и так, чтобы и верхние и нижние пороги были различными для двух каналов. Поскольку тушение вызывается как бесцветными химическими веществами, например водой и ССЦ, так и окрашенными, приготовление стандартов с таким же уровнем тушения, как и у неизвестного вещества, может оказаться трудным. Следовательно, если в образцах неизвестного состава присутствуют окрашенные соединения, вызывающие тушение, особенно в высоких концентрациях, неизбежна ошибка в приготовлении стандарта. Тем не менее данный метод применим в широком диапазоне условий [57]. Двухканальные системы требуют меньше времени для настройки, если только не приходится иметь дело с очень низкими скоростями счета. В последнем случае для получения отношения счетов заданной точности требуется намного больше времени, чем при ис

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.08.2019)