ственно пуриновые основания, в первую очередь гуанин. ЭМС, самый распространенный алкилирующий агент в исследованиях по мутагенезу, действует весьма специфично, вызывая в основном транзиций типа GC—*АТ [10, 22].

Методика

1. Выращивают культуру бактерий, предназначенную для мутагенеза, в L-бульоне (разд. 13.9.1) или питательном бульоне до поздней логарифмической фазы роста (разд. 13.9.11).

2. Смешивают равные объемы культуры и свежеприготовленного исходного раствора ЭМС [0,1 мл ЭМС в 2,5 мл минимальной среды (разд. 13.9.8 или 13.9.15), подогретой до 37 °С].

3. Смесь аэрируют на качалке 1—2 ч при 37°С.

4. Разводят культуру в 10 раз свежей минимальной средой и дают ей возможность расти в течение нескольких часов. В зависимости от того, какой тип мутанта нужно получить, либо обогащают культуры по этому мутанту, либо непосредственно высевают соответствующие разведения для выявления мутантов.

13.2.7. Агенты, излечивающие клетки от плазмид

При добавлении в среду таких веществ, как акридиновые красители, бромистый этидий, додецилсульфат натрия и новобиоцин, а также при повышении температуры из бактериальных клеток могут высвобождаться молекулы плазмидной ДНК (излечивание бактерий) [20]. Плазмидные молекулы, существующие как независимо реплицирующиеся кольцевые молекулы двухце-почечной ДНК, удаляются под действием этих агентов либо из-за нарушения их репликации (вещества акридинового ряда, бромистый этидий и новобиоцин), либо в результате изменения места их прикрепления к мембране (в присутствии додецилсульфата натрия и при повышенной температуре). Поскольку плазмидная ДНК играет важную роль в качестве переносчика генетических факторов устойчивости к антибиотикам и тяжелым металлам, а также факторов, детерминирующих антибактериальные агенты и сложные метаболические функции, методы получения бесплазмидных штаммов вызывают большой интерес у исследователей, занимающихся генетикой бактерий.

Методика

Обычно методика излечивания клеток от плазмид заключается в следующем.

1. Из культуры исследуемого бактериального штамма, находящейся в фазе логарифмического роста, отбирают аликвоты и вносят по 103—104 клеток в ряд пробирок с питательным бульоном (разд. 13.9.11), L-бульо-ном (разд. 13.9.1) или какой-либо другой подходящей средой с излечивающим агентом в различных концентрациях.

13. МУТАЦИИ

2. Инкубируют культуры в течение ночи при обычной для данной бактерии температуре роста.

3. Выбирают культуру, в которой появляется едва заметная мутность, и высевают ее разведения на питательный агар (разд. 13.9.12) или сходную среду.

4. Проверяют отдельные колонии на потерю функций, определяемых плазмидами. Для этого высевают колонии штрихом на агар с антибиотиками (разд. 13.9.4) или наслаивают поверх колоний тонкий слой агара с индикаторным штаммом с целью выявить бактериоцины или другие внеклеточные продукты.

Следует отметить, что оптимальная концентрация агента, излечивающего бактерии от плазмид, может сильно варьировать — в 100 и даже в 1000 раз — в зависимости от того, какая бактерия подвергается обработке, а эффективность излечивания зависит как от штамма, так и от агента, которым обрабатывают клетки.

Для излечивания можно использовать также повышенные температуры инкубации (на 5—7°С выше нормальной температуры роста).

1. Выращивают небольшое количество (5—10 мл) культуры исследуемого бактериального штамма в питательном бульоне (разд. 13.9.11) или другой пригодной для этого питательной среде до поздней логарифмической фазы при повышенной температуре (43 °С для штаммов, растущих нормально при 37 °С).

2. Разводят культуру в 20 раз свежей средой и продолжают выращивание при повышенной температуре. В случае необходимости этот этап повторяют.

3. Высевают соответствующие разведения культуры на питательный агар (разд. 13.9.12) или сходную среду для получения отдельных колоний.

4. Проверяют отдельные колонии на потерю функций, определяемых плазмидами, как описано в п. 4 выше.

5. Чтобы подтвердить потерю плазмид, проводят выделение и фракционирование ДНК по известным методикам (метод выделения плазмидной ДНК см. в гл. 15) и убеждаются в отсутствии плазмидной ДНК в клетках излеченного штамма.

13.3. ЭКСПРЕССИЯ МУТАЦИЙ

Бактерии могут выжить, имея лишь единственную хромосому; в этом смысле они гаплоидные организмы. Однако динамика их деления и репликации хромосомы такова, что почти при любых условиях роста среднестатистическая бактериальная клетка содержит от полутора до двух полных хромосом. Поэтому в культурах, высеянных сразу же после обработки мутагеном, возникшие мутации с потенциально рецессивным фенотипом (например, связанные с ферментативной функцией) могут маскироваться присутствием неизмененной хромосомы в тех клонах, в которых последняя имеется. В связи с этим целесообразно дать культуре, обработанной мутагеном, расти в течение определенного периода времени и тем самым исключить возможность одновременного присутствия в одной клетке хромосомы, содержащей новую мутацию, и прежней хромосомы. Длительность этого периода зависит как от времени деления той или иной бактерии при росте в данных условиях, так и от специфики роста. Для видов или штаммов, клетки которых при росте образуют цепочки или гроздья (например, бациллы, стрептококки, стафилококки), этот период больше, чем для штаммов, растущих в виде одиночных клеток. При излишнем затягивании выращивания мутантные клетки сами начинают делиться, и тогда в одной клетке может присутствовать несколько копий одной мутации. Если хотят получить ряд независимых мутантов одного типа, то лучше всего еще во время индукции мутаций мутагеном или сразу же после нее поделить культуру на порции и затем из каждой порции отбирать после периода выращивания только по одному мутанту. Как было отмечено ранее в описании методов мутагенеза, если время обработки мутагеном достаточно велико, то выращивание проводят одновременно с индукцией мутагеном, тем самым устраняя необходимость в проведении дальнейшего выращивания.

13.4. ОБОГАЩЕНИЕ МУТАНТНЫМИ КЛЕТКАМИ

Обычно возникновение мутаций, даже в том случае, когда их вызывают сильными мутагенами, — относительно редкое событие. В популяциях бактерий частота мутаций может быть, например, такой низкой, как 1 мутант на 106—107 клеток. Выделить мутант, присутствующий на обильном фоне немутировавших клеток, может оказаться нелегко, особенно если применяются непрямые методы выявления. В таких случаях перед выделением мутанта из культуры, подвергнутой действию мутагена, вводят этап обогащения.

В самой распространенной методике обогащения используется антибиотик пенициллин [11, 18]. Когда культуру, содержащую как мутанты, так и немутировавшие клетки, выращивают на искусственной среде, в которой мутантные клетки не растут, пенициллин избирательно вызывает гибель активно делящихся немутировавших бактерий, нарушая в них процесс синтеза клеточной стенки. В оптимальных условиях можно достичь 1000-кратного обогащения мутантами по отношению к немутантам.

13.4.1. Обогащение с помощью пенициллина

1. Выращивают культуру, подвергнутую предварительному действию мутагена, до ранней логарифмической фазы роста (оптическая плотность при длине волны 600 нм — около 0,1, или 15—20 ед. при 660 нм по шкале Клетта).

2. Добавляют 10 000 ед. пенициллина G на 1 мл среды и продолжают инкубацию культуры на качалке до тех пор, пока не прекратится увеличение мутности (обычно 60—90 мин).

3. Удаляют пенициллин либо фильтрованием через стерильный мембранный фильтр (например, фильтр с диаметром пор 0,45 мкм), либо инактивацией его пени-циллиназой. Последний вариант применяют для бактерий, которые при фильтровании резко уменьшают пропускную способность фильтра. Обычно добавляют 100 ед. пенициллиназы на 1 мл и инкубируют 30 мин при температуре выращивания.

4. После центрифугирования при 5000 g в течение 5 мин или фильтрования (см. выше) один раз отмывают клетки свежей культуральной средой и вновь суспендируют их в ней перед проведением этапа отбора или поиска.

13.4.2. Обогащение с помощью циклосерина

Показано, что помимо пенициллина эффективным препаратом, способствующим обогащению культуры спонтанно возникающими мутантами у различных видов рода Pseudomonas, является аминокислотный аналог — D-циклосерин [21]. При добавлении его в количестве 100 мкг/мл в сочетании с пенициллином к растущей культуре Pseudomonas putida он вызывает селективный лизис немутировавших клеток. При этом в течение 1— 2 ч культура обогащается мутантами в 100—1000 раз. Преимущество двойной обработки перед использованием только пенициллина или только циклосерина заключается в том, что в первом случае не выживают спонтанные мутанты, которые устойчивы к каждому из антибиотиков по отдельности. Проведя несколько последовательных циклов обогащения двойной обработкой, можно увеличить относительное содержание в популяции мутантных клеток до значения 106 и выше и тем самым получить реальную возможность выделить мутант, возникающий с очень низкой частотой.

13.5. ПРЯМОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ МУТАНТОВ

Мутанты, которые приобрели какую-либо активность, отсутствующую у немутировавших клеток, могут быть выявлены прямым отбором на соответствующей среде. К таким мутантам относятся клетки, ставшие устойчивыми к различным антибиотикам, бактериофагам или химическим ингибиторам, обладающим в норме бактерицидным или бактериостатическим действием по отношению к немутировавшим родительским формам. Прямым отбором могут быть выделены также мутанты, способные к утилизации нетрадиционных источников углерода или азота. Благодаря высокой разрешающей способности прямого отбора (т. е. способности выявлять немногочисленные мутантные клетки на обильном фоне немутировавших клеток) при его использовании обычно не возникает необходимости в каких-либо приемах по обогащению культуры мутантами. К тому же, поскольку типы генетических функций, подлежащие прямому отбору, ожидаются как доминантные по отношению к их нормальным аналогам в клетках, имеющих более чем одну хромосому, как правило, нет нужды в дополнительно