Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

ует по меньшей мере четыре вида гранулированных гелей: поперечно-связанные декстраны и их производные, полиакриламиды, агарозы и поперечно-связанные агарозы и стиролдивинилбензольные сополимеры. Размеры гранул и степень их пористости могут быть различными; только две фирмы выпускают 180 различных видов гелей. Перечисление всех характеристик этих гелей не входит в нашу задачу, поэтому более подробную информацию можно найти в брошюрах, выпускаемых фирмами. К тому же в них содержится много сведений общего характера.

Многокомпонентный анализ

Правильно подобрав пористость гранул и тщательно разработав экспериментальные условия, можно разделить очень сходные молекулы или, наоборот, молекулы, относящиеся к совершенно разным классам. Особенно трудно разделить смесь различных веществ, но в этих условиях не так важна высокая скорость потока. Поскольку на небольших колонках обычно получают количественные выходы, после разделения компонентов на неперекрывающиеся пики их можно подвергнуть количественному анализу с помощью неспецифических методов. Таким путем можно разделить, а затем обессолить на сефадексе G-15 ряд простых Сахаров, например ра-финозу, мальтозу и глюкозу [28]. Такое разделение основано, как правило, на различиях в молекулярных массах анализируемых веществ. Однако иногда оно обусловлено и другими причинами, вызывающими задерживание определенных молекул в колонке, например адсорбцией полярного растворенного вещества из неполярного растворителя.

Определение константы равновесия

По количеству лиганда, обратимо или необратимо связанного с неизвестным количеством высокомолекулярного вещества, можно рассчитать их константу равновесия или стехиометрию связывания [41] (рис. 16.7). Для этого проводят инкубирование данного вещества и лиганда с последующей гель-фильтрацией на сефадексе G-50, причем уравновешивание и элюцию осуществляют с помощью раствора с такой же концентрацией лиганда, которая использовалась в эксперименте по связыванию. При элюировании концентрация лиганда в пике белка оказывается выше, чем в элюирующем буфере, за счет связывания лиганда с белком, который в этот момент находится в элюате. На участке кривой элюции, соответствующем общему, или «солевому», объему элюата, образуется впадина. Здесь находится исходная инкубационная смесь, из которой удален лиганд, связавшийся с уже вышедшим из колонки белком. Площадь впадины равна площади пика. Определив количество лиганда, исходя из суммы площадей этих пиков,

можно рассчитать соответствующую константу равновесия или стехиометрию связывания, если оно очень прочное. Хроматографирование на колонке (40X2 см) с крупно- или мелкогранулированным сефадексом G-50 весьма эффективно. На рис. 16.7 изображена взятая из работы Хаммела и Дрейера [41] кривая элюирования, полученная на колонке с крупногранулированным сефадексом G-25 (0,4ХЮ см); объем пробы составлял 0,25 мл, а скорость элюирования — 0,3 мл/мин. Значения Vq и Vi-f- V"o определяют с помощью декстрана синего и феррицианида соответственно, для того чтобы рассчитать объем элюата, разделяющий два пика. Объем пробы можно увеличить так, чтобы первый пик занимал весь участок кривой между двумя пиками. Однако ввиду размывания пиков следует использовать не более 66% максимального объема пробы. Например, при разделении на колонке размерами 5X50,8 см КС1 и альбумина объем пробы может быть равен 30 мл, в процессе элюции проба разводится в 5 раз, а между пиками выходит большой объем элюата. Такое же разделение можно получить при объеме пробы 300 мл и ее разведении в 1,5 раза. В качестве элюата используют воду или буфер. Следует отметить, что эта процедура применяется для удаления молекул малых размеров после химической обработки белков (например, растворимых флуоресцирующих реактивов) и для замены одного буфера другим. В последнем случае используется «обессоливающая» колонка, уравновешенная и промытая новым буфером, который служит также и элюентом.

Фракционирование белков и определение молекулярной массы

При проведении гель-фильтрации в препаративном масштабе, например при очистке ферментов и антител, часто приходится идти на компромисс, выбирая между высокой степенью разрешения и большой скоростью потока. Таким образом, хорошее разделение в какой-то мере приносится в жертву при использовании более крупных частиц геля, позволяющих быстрее пропускать через колонку нужный объем жидкости. Пористость частиц должна быть подобрана (часто эмпирически) так, чтобы можно было разделить как можно больше компонентов и чтобы на кривой элюирования нужный компонент располагался между V0 и V0+Vi. Для этого успешно применяется либо только одна гель-фильтрация, либо гель-фильтрация в сочетании с другими способами разделения. Молекулярную массу растворимых белков можно определять с помощью гель-фильтрации на сефа-дексах G-75 и G-100 [30, 50]. Для этого строят график линейной зависимости отношения Vx/Vo, где Vx — объем пика неизвестного компонента, а Ко — свободный объем, от логарифма молекулярной массы ряда ферментов и белков с известными молекулярными массами. Молекулярную массу неизвестного компонента находят по графику. Этот очень полезный метод в основном вытеснен сейчас другим, более быстрым и удобным методом диск-электрофореза в геле (разд. 16.5.1).

Концентрирование

Существует очень простой способ концентрирования растворов высокомолекулярных веществ, не сопровождающегося изменением рН или ионной силы. Для этого к раствору добавляют сухой крупногранулярный сефа-декс G-25. Через 10 или более минут исключенную фракцию отделяют путем центрифугирования в центрифуге с подвесными стаканами или с центрифужными пробирками, снабженными специальными вкладышами с фильтрами.

Выбор материала для гель-фильтрации

Материал для гель-фильтрации должен иметь интервал фракционирования, соответствующий данной цели. Для полного исключения исследуемого вещества используют гель с интервалом фракционирования, верхний предел которого значительно ниже, чем молекулярная масса этого вещества, например, для исключения большинства белков применяют сефадекс G-25 (интервал фракционирования для молекулярных масс от 100 до 5000), а для веществ с молекулярной массой выше 3000 — сефадекс G-10 (интервал фракционирования для молекулярных масс от 0 до 1500). Для полного уравновешивания анализируемого соединения с жидкостью во внутреннем объеме геля (Vi) и последующего элюирования его с «солевым» объемом (Ко+ V^i) выбирают гель с интервалом фракционирования, нижний предел которого превышает молекулярную массу данного соединения. При фракционировании вещества (или веществ) гель должен иметь такой интервал фракционирования, при котором это вещество (или вещества) элюировалось бы с некоторой задержкой, например, для фракционирования сывороточных белков используют сефадекс G-200 (предел исключения 200 000), а для определения их молекулярных масс — биогель А, 0,5 М (предел исключения 500 000).

Степень разрешения зависит главным образом от скорости потока, которая в свою очередь связана с размером и однородностью гранул. Наивысшая степень разрешения достигается при использовании очень мелких гранул и низкой скорости потока. В случае биогелей Р и А для получения максимально возможной степени разрешения необходима скорость потока 2— 10 мл/ч на 1 см2 поперечного сечения слоя гранул, что намного ниже максимальной скорости свободного истечения жидкости для некоторых других гелей. Применение наиболее пористых гелей, например биогелей А50 и 150 М (200—400 меш), требует повышенного гидростатического давления. При использовании биогелей Р-2, Р-4 и Р-6 (400 меш), обеспечивающих разделение малых молекул с высоким разрешением, давление можно повысить до нескольких атмосфер. Величина максимально возможного давления указана в брошюрах, выпускаемых фирмами-изготовителями. При использовании некоторых высокопористых материалов разрушение структуры гранул приводит к сильному снижению скорости потока.

При получении биологических материалов редко создаются такие химические условия, которые могли бы вызвать разрушение матрицы геля. Однако мы приведем здесь в качестве ориентиров некоторые общие характеристики устойчивости нескольких гелей. Декстра-ны, такие, как сефадекс, устойчивы в растворах солей, органических растворителях, растворах щелочей и слабокислых растворителях, но гидролизуются в сильных кислотах. Декстраны во влажном и в сухом состоянии устойчивы при выдерживании их в течение 30 мин при 121 °С и рН 7,0.

Агарозы, например сефарозы, не содержат поперечных сшивок и, следовательно, могут храниться при рН от 4 до 9 и температуре от 2 до 30 °С. Они устойчивы в 1 М NaCl и 2 М мочевине. Поперечно-связанная агароза (сефароза CL) устойчива при рН от 3 до 9, однако при ее использовании следует избегать условий, способствующих ее окислению. Она высокоустойчива в 3 М тио-ционате калия, сильном хаотропном агенте. Перенесение сефарозы CL из воды в некоторые органические растворители сопровождается лишь небольшим изменением размеров пор. Ее можно многократно стерилизовать при рН 7,0 и температуре ПО—120 °С.

Полиакриламиды, такие, как биогель Р, достаточно устойчивы в разбавленных органических кислотах, 8 М мочевине, 6 М гуанидингидрохлориде, хаотропных агентах и детергентах. Для разделения белков рекомендуется использовать буферы с ионной силой 0,5 М. В присутствии некоторых смешивающихся с водой растворителей, например спирта (до концентрации 20%), размеры пор фактически не изменяются. Биогель Р устойчив при комнатной температуре (рН 2—10) и при автоклавировании (121 °С, рН 6—8).

Конструкция и размеры колонок

Во многих случаях применения гель-фильтрации, например при обессоливании растворов, не требуется высокого разрешения, и, следовательно, для этих целей можно использовать самодельные или одноразовые ординарные колонки. Однако в ответственных случаях для успешного разделения веществ с помощью гель-фильтрации, как и во всех других видах хроматографии, нужна надлежащим образом сконструированная колонка и другое связанное с ней оборудование. Следует обратить в

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)