Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

модификации этих материалов, позволяющей расширить спектр их применения. В случае сефарозы 4В ее связывание с лигандами с помощью аминогрупп осуществляют после активации матрицы бромцианом [32]. Частицы сефарозы 4В сферической формы можно изготовить в лаборатории, но они имеются и в продаже, причем в активированной форме.

Если лиганды небольших размеров можно присоединять непосредственно к активированной сефарозе 4В, то крупным лигандам, таким, как белки, часто мешают при этом стерические препятствия, поэтому реакция между матрицей и лигандом протекает медленно и не до конца. Когда же белки вступают в реакцию, то вполне вероятно, что они образуют несколько ковалентных связей с матрицей. К сефарозе, активированной бромцианом, можно присоединить удлиняющие «мостики», которые могут иметь на концах аминогруппы, карбоксильные, тиоловые и другие функциональные группы. Замещенную агарозиую матрицу можно получить в лаборатории [36] или можно купить готовую агарозу с присоединенным к ней в качестве удлиняющего «мостика» алкиламином, конец которого связан с сукцинил-N-cyK-цинимидным эфиром. Эта группа реагирует с алкил- или ариламинами.

ЧАСТЬ IV МЕТАЁО.ЛИЗМ

В случае сефарозы, активированной бромцианом, удлиняющие «мостики» чаще всего получают с помощью реакции с 1,6-диаминогексаном и 6-аминогексановой кислотой. Для присоединения лиганда используют водорастворимый карбодиимид, в результате чего образуются амидные связи. В этой реакции гидрохлорид 1-этил-3- (З-диметиламинопропил)карбодиимида или 1-цикло-гексил - 3- (2-морфолиноэтил) карбодиимидмето-/г-толуол-сульфонат дают хорошие выходы в водных и не водных средах при рН 4,5—6,0.

Использование сефарозы, активированной бромцианом

Активированную сефарозу можно купить в виде лио-филизированного порошка (1 г соответствует примерно 3,5 мл набухшего геля) или приготовить по методу Ак-сена и др. [32]. Сухой порошок промывают несколько раз на фильтре из пористого стекла (G-3), используя для промывания по 200 мл 0,1 М НС1. Промывную жидкость удаляют, отсасывая ее с помощью насоса. Промытый и набухший гель применяют сразу же после приготовления.

Методика связывания лиганда или удлиняющего «мостика» с матрицей

Белок или лиганд, содержащий аминогруппы, растворяют в NaHC03 (0,1 М, рН 8,3) с добавленным к нему 0,5 М NaCl (только для белков). Берут 5—10 мг белка на 1 мл геля. Следует помнить, что нельзя использовать буферы, содержащие амины. Гель и лиганд медленно перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С (магнитную мешалку при этом нельзя применять). Избыточный белок отмывают исходным буфером, а избыток связывающих групп удаляют, обрабатывая реакционную смесь 1 М этаноламином (рН 9,0) в течение 2 ч. Можно использовать и другие амины, в том числе трис-буфер. Конечный продукт промывают 4—5 раз буферными растворами с высоким и низким рН, например 0,1 М ацетатом (рН 4,0) и 0,1 М боратом (рН 9,0), содержащим

1 М NaCI. Смена рН обычно необходима для удаления адсорбированного белка. Суспензии хранят в холодильнике (не замораживая) и добавляют к ним бактерио-статические вещества, если предполагается длительное хранение. Конечно, описанную методику следует модифицировать, если требуется стабилизировать данный белок. Необходимо отметить, что при низких рН CNBr-сефароза стабильна (и не очень реакционноспособна), а при высоких рН становится реакционноспособной.

Аминогексил- или 6-аминогексаноатсефарозу связывают с лигандом карбодиимидным методом. Высушенный материал взвешивают и погружают для набухания в раствор 0,5 М NaCI (1 г = 4 мл геля). Предназначенный для связывания лиганд (белок или низкомолекулярное вещество) растворяют в воде или водном растворителе и доводят рН до 4,5. К сефарозе добавляют такой объем водного раствора гидрохлорида 1-этил-3- (З-диметиламинопропил)карбодиимида, чтобы получилось 10 мг набухшего геля на 1 мл. Гель и карбодиимид перемешивают в течение ночи при комнатной температуре (нельзя использовать магнитную мешалку). Избыток реактивов удаляют промыванием той же смесью воды и растворителя, которая будет использована на последующем этапе связывания лиганда. Полученный конъюгат можно хранить при 4—8°С. Предназначенный для связывания лиганд растворяют в воде или смеси воды и растворителя, доводя рН водной фазы до 4,5, при этом никакого буфера не используют. Величину рН, которая снижается, главным образом в начале реакции, поддерживают на уровне 4,5, добавляя NaOH. Связанный с лигандом гель тщательно промывают связывающим раствором; нет необходимости блокировать избыточные группы. После промывки в дистиллированной воде, а затем в буфере гель готов для использования в аффинной хроматографии. Материал можно хранить при рН 7,0 и температуре ниже 8°С без замораживания.

Получение замещенного агарозо-аффи-геля 10

Агарозо-аффи-гель 10, используемый в аффинной хроматографии, производится фирмой Bio-Rad Laboratories в виде влажной пасты (1 г сухого веса/25 мл).

Удлиняющий «мое гик» и сукцинимидную группу присоединяют к матрице (биогель Л) через сукцинилиро-ванную аминоалкильную группу. Гель промывают на фильтре водой объемом, превышающим в 3 раза объем самого геля. Затем гель смешивают с буфером, например с 0,1 М ацетатом, морсЬолинпропансульфоновой кислотой (МОПС), N-трис(гидроксиметил)метил-2-ами-ноэтансульфоновой кислотой (ТЕС) или НСОз" (рН 5—8,5). Лиганд можно также добавлять в неводном растворителе прямо во влажный сгусток геля или в гель, промытый и суспендированный в растворителе.

Применение связанных с лигандами аффинных сорбентов [20]

Количество необходимого материала для разделения определяют по известной или найденной емкости данного сорбента с некоторыми допущениями в отношении экспериментальных условий, сродства сорбируемого материала и т. д. Обычно используется избыточное количество сорбента, и адсорбированные вещества образуют полосу только в верхней части хромато-графического слоя, поэтому можно работать с небольшими колонками. Как и при геяь-фильтпации, колонки набивают так, чтобы слой сорбента был равномерным и проницаемым для подвижной фазы.

Для адсорбции следует выбрать такой стартовый буфер, который обеспечил бы максимальное связывание, например, белка с лигандом и минимальное взаимодействие между молекулами белка. Таким образом, необходимо учитывать рН и присутствие в реакционной смеси специфических ионов или каких-либо веществ, а буфер должен иметь высокую ионную силу, например содержать 0,5 М NaCl. Пробу вводят в стартовый буфер, и при необходимости ион, содержащийся в пробе, замещают ионом буфера с помощью диализа, мембранного фильтрования или гель-фильтрации.

Элюирование может происходить в результате одного или нескольких сдвигов рЫ, изменения ионной силы или замещения иммобилизованного лиганда родственным или идентичным веществом. При использовании первых двух способов специфичность, характерная для аффинной хроматографии, проявляется только на стадии адсорбции. При элюировании путем специфического замещения иммобилизованного лиганда специфичность проявляется как на стадии адсорбции, так и в процессе элюирования.

Другие аспекты

В тех случаях, когда высоко реакционноспособный носитель предстоит связать с макромолекулами, отличающимися большой чувствительностью к избыточному количеству центров связывания, может потребоваться сократить число связывающих групп в матрице. При использовании CNBr-сефарозы и некоторых других материалов это достигается путем регулируемого гидролиза реакционноспособных групп, в других же случаях — с помощью предварительной контролируемой обработки матрицы низкомолекулярным лигандом. Даже при отсутствии у макромолекул такой чувствительности вполне вероятно, что в процессе их связывания с носителем произойдет некоторое нарушение макромолеку-лярной структуры. У ферментов это проявляется в уменьшении удельной активности и других изменениях каталитических свойств.

После завершения процедуры связывания лиганда с матрицей все оставшиеся реакционноспособные места на матрице следует инактивировать добавлением избытка низкомолекулярного вещества, содержащего ту же реакционноспособную группу, например к сефарозе, активированной CNBr, добавляют этаноламин.

16.3.7. Гель-фильтрация [18, 27]

С помощью сферических гранул с относительно равномерно распределенными по размерам порами можно осуществить различные виды молекулярного разделения, основанные в значительной степени на различиях в размерах молекул. Когда пробу вводят в колонку для гель-фильтрации, наслаивая ее на гель, те молекулы, которые по своим размерам намного крупнее пор сферических гранул, проходят через колонку, вытесняя растворитель и не проникая в гранулы. Они выходят в виде пиков сразу же после того, как через колонку пройдет свободный, илн внешний, объем растворителя (Vo)-Мелкие молекулы, которые свободно уравновешиваются с растворителем во внутреннем пространстве гранул (внутренний объем V,), теоретически должны пройти с элюентом через колонку, как если бы гранул вообще не было, и выйти после того, как пройдет общий объем колонки. Молекулы, занимающие промежуточное положение между этими крайними случаями, «распределяются» в пространстве, находящемся внутри и между гранулами, главным образом в соответствии со своими размерами. Благодаря тому что материалы, используемые для гель-фильтрации, имеют поры самых разных размеров и, следовательно, различаются по своим диапазонам фракционирования, с их помощью можно разделять вещества с молекулярными массами в пределах от МО2 до 5• 106. Если одни молекулы ведут себя «идеально», как это описано выше, то многие другие задерживаются на колонке дольше, чем ожидается. Это обусловлено тем, что такие молекулы связываются с матрицей в результате адсорбции, ионного обмена с небольшим количеством присутствующих в матрице карбоксильных групп или взаимодействия между ароматическими кольцами и матрицей. Таким образом, общий объем колонки Vr равен сумме свободного объема Vq, внутреннего объема Vi и объема матрицы или гранул Vg:

Материалы для гель-фильтрации

Существ

страница 38
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)