Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

в цикле трикарбоновых кислот и в реакциях других метаболических путей, такие, как молочная, лимонная, изолимонная, яблочная, янтарная, ^«с-аконитовая, фумаровая, пировиноградная, ща-велевоуксусная и глиоксиловая, количественно определяют в виде метиловых и триметилсилиловых эфиров. В статье Элкока [29] рассматриваются особые трудности, встречающиеся при анализе некоторых из таких кислот, например ненасыщенных жирных кислот и ке-токислот. Хотя имеется подробное описание нескольких методик, в них используются только аутентичные пробы кислот. Экстракцию же кислот из биологического материала осуществить трудно. Описываемая ниже процедура, основанная на методике Элкока [29], успешно применяется для количественного определения кислот, образуемых бактериями и присутствующих в реакционных смесях.

Кислотность пробы объемом 25 мл доводят до рН 2 с помощью серной кислоты, затем добавляют известное количество маргариновой (гептадекановой) кислоты в качестве внутреннего стандарта и раствор высушивают. К сухому остатку добавляют 5 мл реактива метанол — фторид бора (Applied Science Laboratory, State College, Pa.) и смесь количественно переносят в центрифужную пробирку на 50 мл. Суспензию центрифугируют и осадок дважды промывают небольшим количеством реактива метанол—три фтор ид бора, надосадочные жидкости объединяют и оставляют на ночь. Раствор разбавляют равным объемом воды и экстрагируют трижды 2 мл хлороформа. Слой хлороформа удаляют, экстракты объединяют и избыток хлороформа отгоняют в токе сухого азота.

Хроматографирование можно проводить на 5%-ном диэтиленгликольадипате, нанесенном на очищенный [29] хромосорб W (30—60 меш; длина колонки 244 см, внутренний диаметр 0,64 см), при скорости потока гелия 45 мл/мин. Температуру колонки поддерживают в течение 7 мин при 88°С, а затем повышают ее до 165°С со

16 ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

скоростью 7,5°С в 1 мин. Температуру детектора и дозатора устанавливают при 230 °С.

Анализ щавелевоуксусной, пировиноградной и а-ке-тоглутаровой кислот с помощью этой методики сопряжен с некоторыми трудностями, которые, однако, удалось преодолеть благодаря получению триметилсилил-оксимных производных этих кислот [40].

16.3.5. Жидкостная хроматография под высоким давлением

Разрешающая способность распределительной хроматографии в системе жидкость — твердый носитель повышается с уменьшением размеров частиц носителя, так как при этом увеличивается число циклов разделения и ускоряется установление равновесия между растворенными веществами и стационарной фазой. Эти положительные явления сопровождаются сильным снижением скорости потока, которую можно повысить до приемлемого уровня только с помощью достаточно высокого давления.

Жидкостная хроматография под высоким давлением (ЖХВД) — это новая и быстроразвивающаяся область с большими аналитическими и препаративными возможностями. Все элементы этого метода, включая твердую насадку, предназначены для работы под давлением от 7 до 550 кг/см2. Разделение может быть основано на принципах адсорбции, распределения (в том числе об-ращенно-фазовый и ионпариый варианты) и ионного обмена [24, 28].

Оборудование

Простая и относительно недорогая система включает насос, создающий высокое давление, манометр, клапан для ввода проб, колонку и коллектор фракций или проточный абсорбционный детектор. Жидкость в насос может подаваться с помощью простого устройства для создания градиентов. Все соединения, крепления и колонка должны быть из нержавеющей стали. Набивку колонки при использовании некоторых твердофазных ма

терйалов можно осуществлять в лаборатории. Однако во многих случаях удобно пользоваться готовыми колонками.

Сорбенты для ЖХВД

Для ЖХВД применяют сорбенты двух типов: сферические стеклянные шарики с пористой поверхностью (или с нанесенным на поверхность пористым слоем) и пористые микрочастицы неправильной формы. Связанный со стеклом тонкий пористый слой на поверхности стеклянных шариков (диаметром 37—43 мкм) имеет толщину около 1 мкм. В этом слое и происходит распределительное, ионообменное, а иногда адсорбционное разделение исследуемых веществ. Поскольку набивка колонки такими шариками легко осуществима, их рекомендуют применять в общих или не очень сложных случаях, а также для набивки колонок в лаборатории. Пористые микрочастицы (диаметром 5—20 мкм, чаще всего 10 мкм)—это близкие по размерам частицы си-ликагеля или окиси алюминия, используемые для адсорбционного разделения; силикагель служит также основой для других покрытий, которые связываются с ним через силанольные группы. Емкость и разрешающая способность такой колонки с площадью поверхности около 100 м2/г, намного превышающей площадь поверхности шариков, значительно выше. В качестве покрытий применяют полярную цианоаминовую фазу, Cis-обра-щенную фазу, а также сильные анионо- и катионообмен-ники. Для стеклянных шариков, помимо названных, используют полиамидное покрытие и слои слабых анионо-обменников.

Выбор сорбента и подвижной фазы

В литературе описано довольно большое число методов ЖХВД, и поэтому, прежде чем пытаться подобрать условия для хроматографического разделения, манипулируя множеством переменных параметров, следует поискать уже опубликованное описание методики, применимой к данной конкретной ситуации. Если такой методики нет, то рекомендуется обратиться к тонкослойной хроматографии для подбора подходящего растворителя. В первом приближении водонерастворимые вещества можно разделить путем адсорбции с последующим элюированием в смеси спирт — алкан (5 : 95) или хлороформ — гептан (10:90) либо на полярной цианоаминовой фазе, используя для элюции смесь изо-пропанол — гептан (2:98). Водорастворимые ионизирующиеся вещества, если они проявляют кислотные свойства в растворе, разделяют на сильных анионообменни-ках; если же они представляют собой основания, для их разделения применяют сильные катионообменники. Элюирование можно с успехом провести, используя в первом случае 0,1 М КН2РО4, рН 3,0, а во втором — 0,2 М NH4H2PO4, рН 3,5. Если при использовании покрытий, в которых происходит распределительная хроматография, растворенное вещество элюируется с фронтом, элюент делают более полярным, если же для элюирования вещества требуется более 30 мин, то применяют менее полярный элюент. В том случае, когда при ионообменной хроматографии образец не связывается с сорбентом, следует снизить ионную силу элюента; если же образец элюируется с большой задержкой, надо повысить ионную силу.

Аминокислоты разделяют на пористых микрочастицах, представляющих собой сильные катионообменники, углеводы — на цианоаминовых полярных фазах, нук-леотиды и циклические нуклеотиды — на сильных ани-онообменниках, олигонуклеотиды — на обменниках, содержащих алифатические амины, а водорастворимые витамины — на сильных катионообменниках. Это лишь немногие примеры широкого использования ЖХВД.

Разделение триптических пептидов [39]

Аналитическое картирование пептидов триптических гидролизатов белков можно осуществлять с помощью стандартного оборудования для ЖХВД, снабженного приспособлением для создания линейного градиента. Используется готовая обращенно-фазовая колонка Ci8p-бондапак (10 мкм, 4 ммХЗО см, Waters Associates, Mil-ford).

Для получения триптического гидролизата белок, диализованный против дистиллированной воды и затем лиофилизированный, растворяют в 0,2 н. N-этилморфо-линацетате (рН 8,1) до концентрации 1 мг/мл и инкубируют с трипсином при соотношении трипсина и белка 1 : 100 в течение 16 ч при 37°С. Гидролиз прекращают добавлением уксусной кислоты, после чего образец гидролизата вводят непосредственно в колонку для ЖХВД. Пептиды элюируют пои комнатной температуре в линейном градиенте 0,1%-ная ортофосфорная кислота — ацетонитрил при скорости потока 2 мл/мин и давлении 34-Ю5—68* 105 Па. Фосфорную кислоту фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,5 мкм (MI1-lipore Corp., Bedford), ацетонитрил используется без какой-либо подготовки. За разделением пептидов можно следить, измеряя оптическую плотность элюата при 210 нм; для этого либо вручную отбирают пробы, либо используют детектирование в потоке.

16.3.6. Аффинная хроматография

Аффинная хроматография основана на использовании равновесного состояния высокоспецифического связывания, встречающегося в биологических системах. Этот метод позволяет осуществлять такое разделение веществ, которое невозможно достичь с помощью других способов [19, 20, 22]. Суть метода заключается просто в иммобилизации одного из компонентов обратимо связывающейся системы на твердом носителе и последующем его взаимодействии с другим компонентом (компонентами) этой равновесной системы, приводящем к отделению сопутствующих примесей. Таким образом, разделение основано на специфическом связывании компонентов данной системы, а не на различиях в их физических и химических свойствах. Методы аффинной хроматографии хорошо разработаны. Они используются для разделения и очистки компонентов таких высоко-специфически связывающихся комплексов, как антиген— антитело, гормон—связывающий белок, фермент— лиганд. Основными факторами, определяющими процесс разделения, являются природа и химическая структура матрицы, механизм взаимодействия лиганда с матрицей, наличие удлиняющего «мостика», а также условия сорбции и элюции подвижного связываемого компонента системы. Более подробная информация по этому вопросу содержится в обзорных статьях [19, 20] и в брошюрах, выпускаемых фирмами-изготовителями.

В продаже имеется много различных материалов, применяемых в аффинной хроматографии, в том числе матрицы, или носители, причем связанные с ними удлиняющие «мостики» могут содержать на конце различные функциональные группы или присоединенные к ним широко используемые лиганды, такие, как аденозин-5'-монофосфат. Декстраны, например сефароза 4В (Pharmacia Fine Chemicals) и агарозы, такие, как биогель A (Bio-Rad Laboratories), обладают стабильностью, обеспечивают достаточную скорость потока и имеют удобные размеры частиц, что делает их пригодными для использования в качестве матриц. Разработана химия

страница 37
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)