Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

мпературе до 375°С. Поэтому газожидкостная хроматография (ГЖХ) нашла широкое применение в бактериологии, особенно при исследовании компонентов клетки, в качестве вспомогательного средства при классификации и как способ количественного определения продуктов метаболизма. Метод отличается высокой чувствительностью и во многих случаях точностью и воспроизводимостью. При этом достигается исключительно высокое разрешение, особенно при использовании капиллярных колонок. Однако для реализации всех возможностей этого метода требуется относительно сложное оборудование и некоторый опыт.

Газожидкостной распределительной хроматографии посвящено много теоретических исследований, результаты которых позволяют заранее предсказывать условия, необходимые для разделения и количественного определения веществ. При использовании этого метода приходится иметь дело с большим числом переменных, включая тип и размеры частиц-носителей, природу и состав жидких фаз, размеры колонок и их конструкцию, природу газа-носителя и скорость его прохождения через колонку, температуру колонки и ее программирование, чувствительность и избирательность детектора. Манипулирование этими переменными обеспечивает гибкость метода и возможность приспособления его к изучению различных проблем бактериологии, однако подробное их обсуждение выходит за рамки данного руководства. Подробное описание применения ГЖХ в бактериологии можно найти в работе Митруки [26]. В последующих разделах даются лишь общий обзор этого метода и две прописи, пригодные для классификации и анализа продуктов метаболизма.

Принцип метода

Газ, содержащий летучее вещество, пропускают через длинную трубку, заполненную частицами инертного материала, покрытого полярным или неполярным веществом, которое находится в жидком состоянии при рабочих температурах. Исследуемое вещество распределяется между газовой и жидкой фазами. Хотя между ними не достигается равновесия, распределение вещества зависит от его относительной растворимости в этих фазах. Зона растворенного вещества движется через колонку со скоростью, отражающей его растворимость в жидкой фазе. Вещества с более низкой растворимостью движутся быстрее, чем с более высокой. Зоны выходят из колонки, распределившись в виде приблизительно симметричных пиков (в зависимости от условий) в соответствии со значениями их коэффициентов распределения.

Приборы

Хотя существует большое разнообразие сложных приборов, предназначенных для ГЖХ, чтобы получить удовлетворительные результаты, достаточно иметь блок с обогреваемым входом для введения проб, термостатом для одной или двух колонок, позволяющим осуществлять контролируемое повышение температуры, обогреваемым детектором, регулятором потока газа и самописцем. Удобно также иметь оборудование для охлаждения термостата, позволяющее сократить время между анализами.

Из нескольких типов существующих детекторов два оказались особенно полезными для микробиологических исследований. Детектор, регистрирующий соединения по их теплопроводности, очень удобен для анализа газов, например газов, выделяемых бактериями. Он состоит из нагреваемой электричеством нити, сопротивление которой в основном линейно зависит от температуры. Перенос тепла на чистый газ-носитель и на его смеси с анализируемыми газами измеряется с помощью моста Уитстона. Детектор обладает средней чувствительностью, а линейность показаний сохраняется в диапазоне концентраций, крайние значения которых различаются между собой в Ю4 раза.

Пламенно-ионизационный детектор — это устройство, в котором создается водородно-кислородное пламя для сжигания в нем анализируемых органических веществ, содержащихся в выходящем из колонки газе. Образующиеся при этом ионы и электроны, проходя через пространство между заряженными электродами, приводят к увеличению силы тока. Ток обнаруживают с помощью электрометра. Детектор такого типа нечувствителен к перманентным газам и воде и очень чувствителен к скорости потока массы (1—40 пг/с). Детектируемые количества вещества определяют путем умножения чувствительности на ширину пика.

Существуют детекторы и других типов. Одни из них специфичны для одного-единственного элемента, другие же регистрируют какой-то один класс молекул, не реагируя на молекулы других классов. Электронозахватный детектор, например, чрезвычайно чувствителен к обнаружению структур, способных захватывать медленные электроны (например, алкилгалогениды, сопряженные карбонильные группы, нитраты и т. д.), но не реагирует на углеводороды, спирты, кетоны и другие соединения, не захватывающие электроны [25].

Подготовка пробы и получение химических производных

Анализ биологических жидкостей, клеточных экстрактов и других сложных материалов с помощью ГЖХ может оказаться невозможным из-за присутствия высокополярных и высокореактивных компонентов или ряда мешающих примесей. Кроме того, такие неочищенные пробы могут преждевременно загрязнять жидкую фазу. Поэтому обычно проводят предварительное разделение анализируемой смеси для удаления из нее микроорганизмов, компонентов культуральной среды, белков, смол, солей и т. д. Иногда перегнанные или проэкстра-гированные пробы можно вводить прямо в колонку. При этом, однако, следует иметь в виду, что данный метод неприменим к водным пробам. В некоторых случаях требуется высушивание, гидролиз или количественная химическая обработка проб для получения летучих производных. Эти процедуры часто являются причинами дополнительных ошибок.

Содержащиеся в пробах вещества с недостаточной летучестью в рабочем диапазоне температуры, необходимо подвергнуть модификации. Это может быть превращение Сахаров в триметилсилиловые эфиры, получение метилгликозидов (с помощью метанолиза) полисахаридов и сахарсодержащих гетерополимеров, метиловых эфиров жирных кислот (за исключением короткоцепочечных) и метиловых эфиров N-ацильных производных аминокислот и пептидов, а также образование других производных. Описание специальных методик следует искать в работах, приведенных в списке литературы, а также в других публикациях, где описан анализ веществ, требующих модификации.

Факторы, влияющие на разделение

Колонка. Разрешающая способность колонки возрастает пропорционально корню квадратному из длины разделяющего слоя, а время элюирования линейно зависит от длины этого слоя. Емкость пропорциональна поперечному сечению насадки. Для набивных колонок их длина ограничена максимальным рабочим давлением и вместимостью термостата. Длина капиллярных колонок со слоем неподвижной фазы, нанесенным на их внутренние стенки, ограничена в меньшей степени. Эти колонки могут быть намного длиннее. В большинстве случаев пригодны U-образные или спиральные колонки длиной 2—3 м и внутренним диаметром 2,5 мм, изготовленные из стекла или нержавеющей стали.

Газ-носитель. Для проведения быстрого анализа пробы при высоких скоростях потока, когда происходит быстрая диффузия компонентов пробы, используют водород и гелий. N2 применяют для приближения к состоянию равновесия между фазами при более низких скоростях потока. Повышение плотности сводит к минимуму диффузию растворенных веществ в газовой фазе.

Температура. Понижение температуры улучшает разделение, а ее повышение сокращает время анализа. Выбор температуры должен быть основан на компромиссном решении, принятом с учетом этих факторов.

Жидкая фаза и материал носителя

Хотя четких правил для выбора жидкой фазы не существует, он определяется до некоторой степени характером растворимости исследуемых веществ. Иными словами, для хроматографии полярных веществ используются полярные растворители, и наоборот. Таким образом, полярные вещества элюируются быстрее в случае применения неполярной жидкой фазы. При разделении гомологов элюирование происходит в соответствии с их температурами кипения. Если перед исследователем не стоят какие-то особые задачи, требующие подбора подходящего материала для набивки колонки, более целесообразно воспользоваться адекватной системой, описанной в литературе.

Анализ бактерий на содержание углеводов

Применяемые для этой цели методики исходят из общих методов анализа углеводов [49], гликосфинголи-пидов [43] и гликопротеинов [47]. Сахара, связанные гликозидными связями, освобождаются путем метаноли-за с выделением О-метилгликозидов, и все свободные сахара также превращаются в метилгликозиды тем же способом. При метанолизе гликозидных связей происходит изменение конфигурации молекулы, однако при этом образуется только один аномер. Из свободных Сахаров образуется больше одного аномера, так как в растворе присутствует смесь аномеров.

Собранные и отмытые клетки (около 100 мг сухой биомассы) инкубируют в закрытых пробками пробирках с 2 мкл 4 и. метанольной НС1 (раствор газообразной НС1 в метаноле) при 75 °С в течение 4 ч или 0,5 н. метанольной НС1 при 95 °С в течение 24 ч. Высушенный гидролизат ресуспендируют в метаноле и высушивают несколько раз для удаления НС1. Осадок растворяют в 1—2 мл сухого пиридина, переносят в маленькую коническую пробирку и добавляют 0,2 мл гексаметилдисила-зана и 0,1 мл триметилхлорсилана. Смесь встряхивают в течение 30 с и оставляют на ночь при комнатной температуре. Суспензию центрифугируют, переносят над-осадочную жидкость в чистую пробирку и высушивают при 55°С в токе N2. Осадок экстрагируют 10 мл гек-сана и экстракт упаривают до 0,25 мл. Пробы анализируют в газовом хроматографе при следующих условиях: температура дозатора 245°С, температура детектора 250 °С, газ-носитель N2, неполярная колонка с 3%-ным OV-1 на газ-хроме Q (60—80 меш), размеры колонки 1,8 мХ2,5 мм, температура термостата в течение 5 мин поддерживается при 120 °С, после чего ее постепенно повышают до 200 °С со скоростью 5°С за 1 мин. Можно использовать также полярную колонку с 15%-ным кар-боваксом (20 М, 60—80 меш), нанесенным на промытый кислотой хромосорб W при 120°С.

С успехом применяются и некоторые другие методики [34, 35, 37, 38, 41, 51]. См. также разд. 17.2.

Кислоты — промежуточные или конечные продукты метаболизма (см. также разд. 16.3.1 и 18.5.2)

Кислоты, образующиеся

страница 36
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2019)