Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

по меньшей мере на одну единицу отличаться от изоэлектрической точки или значения рК для диссоциируемой группы. При работе с анионооб-менниками по возможности следует применять катион-ные буферы [алкиламины, аммиак, веронал, имидазол и трис(гидроксиметил)аминометан (трис)], а при использовании катионообменников — анионные буферы (ацетат, веронал, цитрат, глицин и фосфат). Для ди-этиламиноэтилсефадекса рекомендуются значения рН от 2 до 9, а для карбоксиметилсефадекса — от б до 10. Ионная сила влияет на связывание ионов и, следовательно, на емкость ионообменника. Рекомендуется применять буферы с относительно высокой ионной силой (около 0,1 М), однако их концентрация должна быть несколько ниже, чем та, которая необходима для элюирования нужных ионов.

Разрешающая способность колонки определяется ее высотой. Если зона поглощенных ионов имеет ширину 1—2 см, то для начала рекомендуется использовать слой сорбента высотой 20 см. При заданной высоте слоя емкость колонки линейно зависит от площади ее поперечного сечения.

Элюирование осуществляют, либо изменяя рН, что приводит к уменьшению или устранению ионного заряда, либо путем повышения ионной силы до такой величины, при которой ион буфера вытесняет интересующий нас ион. Элюцию проводят с помощью ступенчатого или постепенного изменения указанных параметров. В случае анионообменников снижают рН или повышают ионную силу, при использовании же катионообменников элюирование осуществляют путем повышения рН или ионной силы.

Вначале необходимо определить либо общее содержание ионов в пробе, либо размеры колонки, так как емкость — это свойство, зависящее от объема ионооб-менника конкретного типа. Ионный состав пробы должен быть таким же, как и ионный состав исходного буфера. При необходимости ионный состав пробы изменяют на желаемый с помощью гель-фильтрации на сефа-дексе G-25, диализа или разбавления. Объем пробы не имеет большого значения при всех программах элюи-рования, кроме того случая, когда в качестве элюента используют только исходный буфер. Пробу следует вводить так, чтобы она не смешивалась с поступающим в колонку элюирующим буфером и чтобы слой сорбента при этом не нарушался.

Как и в других видах хроматографии, в данном случае также имеет большое значение использование специально сконструированных стеклянных колонок, которые удобны для набивки, введения в них элюента и пробы, выдерживают высокое давление (когда оно необходимо), позволяют регулировать скорость потока и предотвращать высыхание сорбента, а также имеют минимальный объем над слоем ионообменника и под ним. Кроме того, необходимо установить критерии, по которым можно судить о достижении поставленной цели, и определить эффективность колонки, анализируя эф-флюент (элюат).

2QI

16.3.2. Адсорбционная хроматография

Адсорбция — это процесс, обусловленный вандерва-альсовыми силами, электростатическим и гидрофобным взаимодействиями, а также стерическими факторами. Адсорбция индивидуального вещества описывается типичной изотермой адсорбции Ленгмюра, которая представляет собой гиперболу на графике зависимости концентрации растворенного вещества от количества адсорбированного вещества. Такой же кривой описывается и насыщение фермента субстратом, а также «закон убывающего плодородия». Поверхностную сорбцию и элю-цию неполярных веществ успешно осуществляют с помощью силикагеля, кизельгура, окиси алюминия, фло-рисила и активированного угля. Полярные макромолекулы, такие, как белки и нуклеиновые кислоты, очищают либо методом статической сорбции, либо в условиях колоночной хроматографии с использованием гидрокси-апатита, кальций-фосфатного геля или Су -модификации окиси алюминия.

Типы адсорбентов

Для очистки простых и сложных липидов, жирных кислот, стеролов, фенолов и углеводородов используют кремневую кислоту. Элюирование осуществляют путем изменения состава растворителя (обычно от среднепо-лярного к полярному). Разделение стероидов, алкалоидов, углеводородов, сложных эфиров, органических кислот и оснований, а также других органических веществ проводят на нейтральной окиси алюминия (рН 6,9—7,1) в безводных растворителях. Основная окись алюминия (рН 10—10,5) обладает такими же свойствами в отношении соединений, адсорбируемых из органических растворителей. Однако в водной среде она действует как сильный катионообменник, сорбирующий основные соединения, например аминокислоты и амины. Промытая кислотой окись алюминия (рН 3,5—4,5) действует как анионообменник в водной среде. Для очистки макромолекул в водных растворах используются такие адсорбенты, как окись алюминия, CY, кальций-фосфатный гель и гидроксиапатит. Они хранятся в виде концентрированных суспензий, которые не очень пригодны для колоночной хроматографии, хотя для гидроксиапатита описаны такие методы [45].

Разделение белков

Периодический процесс разделения белков осуществляют путем их адсорбции и последующего элюирования. Условия проведения такой процедуры следует установить в ходе контрольных опытов с каждой партией адсорбента и обычно с каждым препаратом белка (фермента или антитела), предназначенным для разделения. На рис. 16.6 представлены результаты проведения циклов адсорбции и элюирования, полученные в контрольных опытах. На рис. 16.6, Л показаны три процесса адсорбции, различающиеся в зависимости от природы очищаемого материала, примесей и других параметров, например рН и ионной силы. Интересующий нас белок может адсорбироваться лучше, чем белки-примеси (слева), так же, как они (в центре), или хуже (справа). В первом случае к раствору добавляют такое количество адсорбента, какое необходимо для извлечения основной части нужного вещества, при этом большинство других белков остается в растворе (положительная адсорбция). Если нужный белок адсорбируется хуже примесей, то адсорбент добавляют, а затем удаляют до тех пор, пока не начнется адсорбция нужного белка (количество адсорбированного белка должно составлять около 10%). В этом случае вначале удаляются белки-примеси (отрицательная адсорбция), после чего нужный частично очищенный материал можно адсорбировать или очистить каким-либо иным способом. Если примесный и основной белки адсорбируются с одинаковой скоростью, адсорбция может привести лишь к небольшой степени очистки. Тем не менее можно добиться положительных результатов, подвергнув очищаемый белок последовательным циклам адсорбции и элюции.

На рис. 16.6, Б показаны три типа элюции. Нужные вещества могут элюироваться раньше, чем белковые примеси (слева), одновременно с ними (в центре) или после них (справа). Если очищаемый материал элюиру-ется раньше, адсорбент следует обрабатывать ограниОтбрасываемая фракция

Рис. 16.6. Использование адсорбции и элюции для очистки ферментов (Объяснения в тексте.) ченным объемом элюента или проводить элюирование циклами для удаления большей части адсорбированного материала, оставляя примеси на адсорбенте. Если вначале элюируются другие белки, адсорбент следует обрабатывать элюентом с возрастающей ионной силой, изменяя рН или сохраняя его прежним до тех пор, пока в элюате не появится значительное количество нужного вещества. Затем условия элюирования изменяют так, чтобы элюировались нужные вещества. Очевидно, что если при адсорбции и элюировании не наблюдается различий в поведении основного вещества и примесей, следует либо заменить данную методику, либо подобрать новые условия.

В такой работе используется главным образом чисто эмпирический подход. Однако график, построенный на основании небольших контрольных опытов, демонстрирующих поведение нужного вещества и примесей, служит хорошим подспорьем при разработке общей методики. Обычно повышение ионной силы и изменение рН в сторону изоэлектрической точки белка приводят к усилению элюирующей способности элюента. Кроме того, субстраты, эффекторы и другие лиганды, связывающие ферменты и другие белки, часто действуют как специфические элюирующие агенты.

Разделение липидов (см. разд. 17.3.3.)

Разделение фосфолипидов с помощью тонкослойной хроматографии описано в разд. 17.3.4.

16.3.3. Жидкостно-жидкостная распределительная хроматография

В двухфазной системе растворителей смесь веществ, частично растворимых в каждом из этих растворителей, после достижения равновесия распределяется между двумя фазами в соответствии с их растворимостью в каждой из фаз. На основе этого явления разработаны полезные методики периодической и непрерывной экстракции различных веществ. Экстракторы для противо-точного распределения Крейга и Подбильняка — примеры наиболее удачных аппаратов такого типа. Однако возможность разделения сходных веществ с помощью этого метода ограничивается числом циклов распределения, которые можно осуществить. К счастью, когда одна фаза двухфазной системы иммобилизована в виде слоя, находящегося на поверхности малых частиц, процесс распределения может многократно повторяться при использовании хроматографии в колонке, заполненной порошком целлюлозы, или на бумаге. При этом вещества разделяются в результате распределения их между водной фазой, покрывающей целлюлозные волокна, и неполярной фазой, протекающей через пространство между волокнами. Кремневая кислота или целит также широко используются в качестве носителей при распределительной хроматографии как в колонках, так и в тонком слое. Разделение веществ с помощью кремневой кислоты в колонках описано в разд. 18.5.2, а в тонком слое — в разд. 17.3.4. Газовая хроматография (разд. 16.3.4) и некоторые виды жидкостной хроматографии под высоким давлением (разд. 16.3.5) также основаны на распределении растворенных веществ.

16.3.4. Газожидкостная распределительная хроматография

Один из наиболее универсальных методов разделения, идентификации и количественного определения биологически важных соединений основан на распределен нии летучих растворенных веществ между подвижной фазой — газом-носителем — и жидкой фазой, нанесенной на инертные частицы. В принципе с помощью этого метода можно анализировать любое соединение, которое становится летучим или может быть превращено в летучее соединение при те

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2019)