Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

тате чего они могут разделиться, если колонка имеет достаточную длину. Однако диффузия ионов ограничивает разрешающую способность колонки и в этом случае. При изменении рН или ионной силы происходит элюирование сорбированных ионов с различными значениями рК или возрастающим сродством.

Градиентная элюция

Элюирование сорбированных молекул путем непрерывного изменения состава элюента — это полезный прием, позволяющий максимально повысить разделительную способность хроматографической системы. Вместо ступенчатого изменения концентрации раствора с помощью различных элюентов осуществляют ее непреРис. 16.5. Система для создания линейного градиента. Площади поверхностей химических стаканов / и 2 равны. 3 — стержень для размешивания, 4 — магнитная мешалка.

рывное изменение в заданных пределах. Используемые при этом методики и оборудование могут быть самыми разнообразными — от очень сложных, как в случае де-вятикамерного прибора для элюирования, применяемого при разделении аминокислот на смоле дауэкс-50 (Na+), до относительно простого устройства для создания линейного градиента путем смешивания двух компонентов. В последние годы при хроматографии чаще всего используют простой линейный градиент. Для этой цели два сосуда Г46] соединяют между собой посредством сифона (рис. 16.5) и один из них (смеситель) присоединяют к колонке. С помощью мешалки, которой снабжен смеситель, поддерживается однородный состав элюента. Если оба сосуда сообщаются с атмосферой и имеют одинаковую площадь поперечного сечения, состав элюента изменяется линейно от состава раствора в смесителе до его состава в резервуаре. Крутизна градиента зависит от объема растворов, содержащихся в обоих сосудах.

Предположим, что необходимо создать такой градиент, чтобы можно было собрать 25 фракций объемом 10 мл, в которых концентрация соли возрастает линей* но от 0,01 М калийфосфатного буфера (рН 7) до 0,01 М фосфата (рН 7)+0,01 М КС1. Общий объем, необходимый для создания градиента, равен 250 мл. Прежде всего берут два химических стакана на 250 мл, которые устанавливают так, чтобы их можно было соединить П-образной стеклянной трубкой (рис. 16.5), или используют химические стаканы, один из которых (резервуар) имеет внизу одно выходное отверстие, а другой (смеситель) — два. Смеситель помещают на магнитную мешалку и соединяют выходное отверстие посредством трубки с колонкой. В резервуар добавляют 125 мл фосфатного буфера + KCl, а в смеситель—125 мл того же фосфатного буфера без КС1. Независимо от этой установки через колонку пропускают сверху некоторое количество 0,01 М фосфатного буфера для уравновешивания системы исходным элюентом. Затем начинают элюирование, пропуская через колонку раствор из смесителя. Элюирование продолжают при перемешивании до тех пор, пока все содержимое сосудов не перетечет в колонку. Линейность градиента проверяют, определяя во фракциях количество хлорида. Необходимо предотвратить перемешивание содержимого двух сосудов до начала элюирования, поэтому входное и выходное отверстия в смесителе должны быть снабжены зажимами.

Если отношение площади поперечного сечения резервуара к площади поперечного сечения смесителя больше 1, то градиент будет «выпуклым», а если меньше J, то «вогнутым», согласно уравнению

С2=С,—D(l — v)AifA*,

где С2 — концентрация раствора в смесителе (нижний уровень), С\—концентрация раствора в резервуаре (верхний уровень), D — разность между этими концентрациями, v — доля первоначального объема, вытекшего из сосуда к данному моменту времени, а А\ и А2 — площади поперечного сечения сосуда, содержащего раствор с более высокой концентрацией, и сосуда, в котором происходит смешивание растворов, соответственно.

Следует отметить, что при обычном методе создания градиентов, когда элюент с более высокой концентрацией по каплям добавляется из делительной воронки в смеситель, содержащий раствор с постоянным объемом, получаются выпуклые градиенты, которые дают недостаточно хорошие результаты.

Более сложные градиенты можно создавать, используя несколько расположенных в ряд сосудов, причем смешивание растворов происходит только в последнем. В каждом из сосудов могут быть разные элюенты, что и приводит к получению сложного градиента. Для этой цели создано градиентное устройство из девяти камер [48].

Нуклеиновые кислоты

Для разделения нуклеотидов, нуклеозидов, пурино-вых и пиримидиновых оснований используют анионо- и катионообменники с низкой степенью сшивки. При этом осуществляется строгий контроль ионной силы, рН и неионного связывания. 5'-нуклеотиды разделяют с помощью дауэкса-5С^-Х4 (Dow Chemical Со.) или AG50W-X4 (Bio-Rad Laboratories). Пробы в 0,1 — 1 мл элюирующего буфера наносят на колонку длиной 40 см и элюируют 0,1 М формиатом аммония с рН, доведенным до 3,2 муравьиной кислотой, со скоростью 1 мл/мин. Для разделения 2'- и З'-нуклеотидов используют колонку длиной 85 см, а в качестве элюирующего буферного раствора 0,25 М формиат аммония с рН, доведенным до 4,1 муравьиной кислотой [33]. В другой системе, в которой для контроля неионного связывания применяют градиент соли и этанол, рибо- и дезоксирибоолигощ клеоти-ды разделяются в зависимости от нуклеотидного состава, длины цепи и наличия 3'- или 5'-концевых фосфатных групп [31]. По одной методике используют колонку размером 60X0,3 см с AG1-X2 (400 меш, Bio-Rad Laboratories). Разделение проводят со скоростью 12 мл/ч, используя для элюции 400 мл 20%-ного этанола, содержащего линейный градиент 0—1,0 М NH4C1 (рН 10). По второй методике в колонке 100X0,2 см с дауэксом 1-Х4 (400 меш) применяется следующая программа введения пробы и элюирования: 0,4 мл 1 М NaOH, 1 мл 20%-ного этанола, по 1 мл воды и пробы, 1 мл 20%-ного этанола, после чего через колонку пропускают 200 мл этанола, содержащего линейный градиент 0—0,5 М NH4C1 (рН 10), со скоростью 6—10 мл/ч.

Циклические нуклеотиды в гомогенизированной, де-протеинизированной и нейтрализованной пробе разделяют на колонке размером 0,5X4 см со смолой AG1-X8 в формиатной форме (200—400 меш), уравновешенной ОД и. муравьиной кислотой. После введения пробы через колонку пропускают по 10 мл воды, 2 М муравьиной кислоты и 4 М муравьиной кислоты, а затем по 10 мл 8 М муравьиной кислоты, содержащей 20 мМ, 100 мМ и 1 М формиат натрия [42].

Промежуточные продукты цикла трикарбоновых кислот [44]

0,5 мл экстракта, доведенного до рН б, вводят в колонку размером 0,9X14 см с AG1-X10 в формиатной форме. Для элюирования необходимо 150 мл градиента, создаваемого при добавлении 3 М муравьиной кислоты в закрытый смеситель на 250 мл, наполненный водой. Затем через колонку пропускают 2 н. формиат аммония со скоростью 2 мл/мин. р-Гидроксибутират, аце-тоацетат, сукцинат, малат, пируват, цитрат (изоцитрат), а-кетоглутарат и фумарат элюируются в перечисленном порядке в виде отдельных пиков.

Ионообменники на основе целлюлозы, декстрина и агарозы [46]

При разделении макромолекул используют модифицированные природные полимеры, которые по ионообменной емкости и другим свойствам обычно более пригодны для этой цели, чем искусственные смолы. В случае декстрана и агарозы можно контролировать степень их поперечного связывания и размеры частиц, регулируя тем самым сжатие и набухание ионообменников и обеспечивая их высокую емкость для макромолекул при высоких и средних скоростях потока.

Поскольку белки амфотерны и имеют большое число зарядов, часто сгруппированных в виде скоплений, с ними можно обращаться как с катионами или анионами, выбрав значение рН для их ионообменного разделения на одну или несколько единиц выше или ниже йзоионной точки или величины pi. В повторяющихся

циклах связывания и элюирования используется изменение рН, приводящее к исчезновению ионных групп, т. е. карбоксильных или аминогрупп на молекулах белка или частицах ионообменника. Элюирование можно осуществлять также путем замещения одного иона другим.

Диэтиламиноэтилпроизводное целлюлозы, декстрана или агарозы представляет собой слабый анионообмен-ник (р/С^ 9,5; табл. 16.3). Поэтому в нейтральной среде аминогруппа протонируется и связывает белки и пептиды, если рН среды приблизительно соответствует или превышает величины их pi.

Карбоксиметилпроизводные тех же носителей представляют собой катионообменники с рК около 3,5. Разделение обычно проводят при рН выше 4. Сорбция происходит эффективно, если рН разделения ниже изоэлект-рической точки белка и выше 4.

Эктеола-целлюлоза и такое же производное декстрана имеют рК 7,5. Этот иоиообменник хорошо зарекомендовал себя при хроматографии нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов.

Практические замечания

Успешное использование ионообменников основано на разумном выборе ряда параметров, таких, как тип обмена, состав буфера, рабочее значение рН, ионная сила, вид матрицы, размер ее частиц, форма и пористость, а также размеры колонки и программа элюирования. Кроме того, необходимо обратить внимание на набивку колонки, введение пробы, поддержание низкой вязкости исследуемого раствора и конструкцию колонки, поскольку эти факторы также определяют степень разрешения. Обсуждение этих аспектов во всех деталях выходит за рамки данной главы, поэтому здесь будут рассмотрены только общие рекомендации по каждому из перечисленных факторов. Подробную информацию по всем этим вопросам можно найти в работе Блэттнера и Эриксона [33], а также в брошюрах, издаваемых фирмами Whatman, Inc. (ионообменные целлюлозы) и Pharmacia, Inc. (сефадексы).

Сферические декстрановые гранулы одинаковых размеров и формы (сефадекс) обеспечивают обычно более высокие скорости потока, хотя выпускаемые сейчас производные целлюлозы также дают хорошие результаты в этом отношении. При использовании шариков или частиц меньших размеров скорость потока снижается и разделение соответственно улучшается. Повышение пористости частиц приводит к увеличению емкости ионо-обменника для данной молекулы, что особенно важно при работе с макромолекулами. Выбор ионообменника зависит от того, в каких ионных формах находятся вещества, которые предстоит разделять. Выбранное значение рН должно

страница 34
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)