Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

ссеянный свет возникает из-за неполного удаления нежелательных длин волн в результате несовершенства конструкции или загрязнения оптики. Примесь рассеянного света в выходящем световом пучке искажает линейную зависимость оптической плотности от концентрации хромофора, т. е. нарушает выполнимость закона Ламберта — Бэра. Исследователь должен определить диапазон длин волн, в котором линейная зависимость сохраняется.

Так как примесь рассеянного света возрастает при уменьшении длины волны, простой и надежный способ определения рассеянного света в приборе заключается в использовании в качестве граничных светофильтров (пропускание резко уменьшается в коротковолновой области) обычных растворителей [5]. На рис. 16.2, Л показана зависимость оптической плотности от длин волн для нескольких растворителей. Резкое отличие оптической плотности, измеряемой обычными лабораторными спектрофотометрами, от ее номинальных значений указывает на то, что рассеянный свет преобладает над монохроматическим. Поэтому невозможно измерять оптическую плотность растворов в области спектра, где примесь рассеянного света становится значительной. Влияние процентного содержания рассеянного света на выполнимость закона Ламберта — Бэра показано на рис. 16.2,5 [4]. Процентное содержание рассеянного света представляет собой пропускание, выраженное в процентах, при длине волны, где граничный светофильтр непрозрачен.

Новейшие широко используемые спектрофотометры позволяют производить точные измерения оптической плотности при ширине полосы 0,2—0,3 нм (2,0—3,0 А), но эта возможность может быть утрачена в результате загрязнения оптики, флуоресценции образцов или вследствие проникновения постороннего света.

Точность и линейность фотометрических измерений

В некоторых спектрофотометрах невозможно регулировать калибровку фотометрического блока, и линейность показаний лишь предполагается. Поэтому, по крайней мере для одного спектрофотометра, нужно провести калибровку с помощью прилагаемых стандартов с известной величиной оптической плотности. В любом случае следует определить точность и линейность измерения оптической плотности и, если необходимо, составить таблицу погрешностей. В тех приборах, которые позволяют проводить калибровку шкалы оптической плотности, для ее настройки можно использовать набор нейтральных стандартных светофильтров с известными значениями оптической плотности при определенных длинах волн. Если показания фотометра линейно зависят от оптической плотности светофильтров, то прибор считается откалиброванным. Национальное бюро стандартов и некоторые компании поставляют стандартные стеклянные светофильтры или дают инструкции по приготовлению жидкостных стандартов оптической плотности [3, 7].

фильтр в держателе таким образом, чтобы в пучок света можно было поместить либо образец сравнения (воздух или воду), либо фильтр, и выставить нуль фотометра на образце сравнения; 2) поместить светофильтр на пути света и определить оптическую плотность (A0l);

3) вновь поместить в пучок света образец сравнения (воздух или воду) и уменьшить щель так, чтобы образец сравнения дал какое-либо произвольное значение оптической плотности (Ах), например 0,1; 4) снова установить светофильтр и измерить оптическ>ю плотность (Л0 ). Истинная оптическая плотность при таком измерении равна Ат (или AN) + Ах. Наблюдаемая оптическая плотность равна Ао +Ах. Этот процесс можно повторять несколько раз, уменьшая щель, когда в световом пучке находится образец сравнения, для получения величины оптической плотности Ау и определяя затем оптическую плотность светофильтра Ао2 . В результате получают ряд истинных и наблюдаемых значений оптической плотности, постепенно возрастающих от Ат через определенные интервалы на шкале оптической плотности. При более низком значении Ат число точек, необходимое для определения линейности, следует увеличить. На рис. 16.3, А изображен график зависимости наблюдаемых значений оптической плотности от истинных для данного прибора. Если прирост значений на графике постоянен, то показания фотометра линейны. На рис. 16.3,5 показана зависимость ошибки (Ао—Ат)!) наблюдаемых значений оптической плотности (А0) от истинных значений поглощения. Этот график особенно наглядно показывает отклонение от линейности и величину ошибки.

Влияние ширины щели

1) Вместо (4о~4т) следует читать (ДЛо—ДЛт).— Прим. ред.

Для призменных монохроматоров, работающих при определенной выставленной щели, характерна сильно выраженная нелинейная зависимость спектральной ширины полосы от длины волны. В руководствах по эксплуатации спектрофотометров приводятся графики та16. ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

юо

кой зависимости; один из них для примера приведен на рис. 16.4. Таким образом, чтобы провести измерения при постоянной спектральной ширине полосы с помощью призменной оптики, необходимо установить ширину щели в соответствии с графиком. Для точного определения концентрации растворенного вещества следует установить такую же ширину щели, как и при определении коэффициента поглощения. С другой стороны, вместе с результатами определения коэффициента поглощения необходимо указывать и спектральную ширину полосы. При работе с призменными приборами

приводят как ширину щели, так и график зависимости ширины полосы от длины волны для данного прибора.

Аналогичным образом спектры следует регистрировать при постоянной ширине полосы, а не при постоянной ширине щели. Величины оптической плотности при определенной длине волны или спектры поглощения, полученные при двух различных значениях ширины щели, редко бывают идентичными. Погрешность увеличивается при наличии острых максимумов и может быть незначительной в случае широких максимумов. Поэтому целесообразно использовать минимальную ширину щели.

Кроме того, ширина щели зависит от чувствительности фотометра, спектральных характеристик фотодетектора, а также от источника освещения. Еще более важно то, что на ширину щели сильно влияют мощность лампы, чистота оптических поверхностей и качество фокусировки источника. Считается, что у средник спектрофотометров нулевая линия должна устанавливаться при 210 нм или при меньшей длине волны при ширине ще

ли 2 мм. Если этого нельзя сделать, то следует проверить перечисленные выше факторы.

Сравнение однолучевых и двухлучевых спектрофотометров

Двухлучевые спектрофотометры сконструированы таким образом, что благодаря наличию в них двух пучков света они позволяют осуществлять одновременное или параллельное сравнение интенсивностей /о и /т; в одно-лучевых приборах эти два измерения проводят последовательно. В двухлучевых спектрофотометрах пучок света разделяется так, что одна его часть проходит через раствор, используемый для установки прибора при /о— %Т= 100 или Л0 = 0, а другая — через образец для измерения %Т или А\. Для получения достоверных результатов необходимо, чтобы параллельные оптические системы и соответствующие электронные устройства работали идентично. Это осуществляется с помощью особых приспособлений, имеющихся сейчас во многих современных приборах. В однолучевых спектрофотометрах для достижения той же цели вначале устанавливают %Т = 100 или А=^0 для образца сравнения, а затем определяют %Т или А, помещая в пучок света измеряемый образец.

Широко распространено мнение о том, что двухлучевые спектрофотометры лучше, чем однолучевые. Часто считают, что однолучевые приборы недостаточно точны. Это верно только в особых случаях. Двухлучевой спектрофотометр имеет преимущество, когда необходимо быстро снять спектр, а также когда источник света од-нолучевого прибора нестабилен или наблюдается быстрый дрейф нуля. Двухлучевые приборы очень удобны для прямой регистрации дифференциальных спектров. Однако нет никакой необходимости использовать их для отдельных измерений оптической плотности, например при колориметрических определениях и других обычных спектрофотометрических измерениях.

Регистрация спектров

Спектры удобнее всего регистрировать с помощью двухлучевого спектрофотометра, снабженного самописцем. В одну кювету помещают образец сравнения (какой-нибудь буферный раствор), а во вторую — измеряемый образец в том же растворителе. Чтобы повысить разрешение, устанавливают как можно более узкие щели и осуществляют сканирование при низкой скорости. При проведении важных экспериментов следует убедиться, что концентрация хромофора соответствует области линейных показаний прибора, что флуоресценция не мешает измерениям при высоких концентрациях хромофора (это проверяется с помощью флуориметра) и что прибор откалиброван по длинам волн.

Для определения спектра с помощью однолучевого спектрофотометра вручную устанавливают необходимые значения длин волн. Используя образец сравнения, прибор ставят па 0 при каждой длине волны и определяют оптическую плотность образца. Затем строят график, откладывая по оси х длину волны (в нанометрах), а по оси // значения А. Такой способ определения спектров, хотя и трудоемок, однако вполне приемлем для многих целей.

Определение концентрации веществ в растворах

С помощью правильно откалибровапного спектрофотометра концентрацию растворенного вещества можно определить в стандартных кюветах с длиной оптического пути 1 см непосредственно по оптической плотности при определенной длине волны, если известен молярный коэффициент поглощения (г) этого вещества при данной длине волны: Л/г (моль/л или ммоль/мл). Однако ни высококачественный спектрофотометр, ни определение коэффициента поглощения не нужны в тех случаях, когда имеется чистое вещество, с помощью которого можно откалибровать даже колориметр, снабженный фильтрами. При этом получают стандартный график зависимости оптической плотности от концентрации для серии стандартных растворов, концентрацию вещества в которых можно измерить непосредственно или определить по цветной реакции. Графики показывают линейный диапазон и ошибки отдельных измерений. Можно применять стандартную статистическую обработку данных, т. е. определение воспроизводимости измерений, построение прямолинейных графиков методом наименьших квад

страница 30
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.08.2019)