Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

азования выпуклого мениска.

5. Пользуясь чистым пинцетом, предметные стекла тщательно прополаскивают в растворе гипофазы и укрепляют их под углом 30—45° у внутреннего края чашки.

6. Распыляют небольшое количество порошка талька тонкого помола на половину пути между местом нанесения раствора ДНК и нижним краем стекла. Тальк наносят с помощью пастеровской пипетки, один конец которой прикрыт бумажной тканью, а другой соединен с грушей. Можно также нанести тальк кисточкой из верблюжьей шерсти.

Порошок талька служит для определения границ монослоя во время растягивания пленки, к тому же он обеспечивает некоторое сжатие пленки, удерживая края монослоя.

7. Добавляют в 5-мл стакан разового использования

95 мкл раствора прошедшей отжиг ДНК и 5 мкл свежеприготовленного на дистиллированной воде раствора (2 мг/мл) цитохрома с (Sigma, тип II).

Раствор ДНК с цитохромом с набирают с помощью какого-либо механического наборного устройства в пипетку с надетым на нее 100-мкл пластмассовым наконечником (его кончик должен быть отрезан).

8. Раствор ДНК с цитохромом с медленно выливают на предметное стекло на высоте около 0,5 см над

водной поверхностью. Между наконечником пипетки и

гипофазой на стекле постоянно должен быть перешеек

жидкости. Стараются не дышать над поверхностью и не

двигать предметное стекло. Как только сформируется

белковый монослой, тальк сразу же перемещается с

предметного стекла к краям чашки.

Если образуются завихрения, часть талька по кругу возвращается обратно к стеклу, а пленка цитохрома занимает область, свободную от талька.

9. Через 1 мин после растягивания монослоя по поверхности берут пинцетом покрытую парлоидем сетку и

осторожно опускают ее парлодием вниз на монослой

белка; после некоторой паузы поворачивают и поднимают сетку под углом 20—30°. В норме сетка должна быть

покрыта большой плоской каплей. Таким способом готовят две — три сетки с монослоем из разных участков

поверхности.

10. Окрашивают образец, погружая сетку в 5-10~5 М уранилацетат на 30 с.

11. Опускают сетку в изопентан на 10 с, чтобы облегчить высушивание.

12. Одно- и двухцепочечные участки ДНК должны быть видны в электронном микроскопе без натенения, но натенение позволяет лучше их различать. Закрепляют сетки на предметном стекле при помощи липкой с обеих сторон ленты и затем напыляют их при вращении под углом около 7°, используя для этого 1,2-см отрезок платино-палладиевой (80 : 20) проволоки 23-го размера (Ted Pella, Inc.) в вольфрамовой корзине (Е. F. Fullam, Inc.). Разрежение в камере испарителя напыляющего аппарата перед напылением должно быть меньше б*10~5 мм рт. ст.

13. Теперь сетки готовы к просмотру в электронном микроскопе. 20 разных гетеродунлексных молекул дают статистически надежные картины для измерения одно-и двухцепочечных участков. В качестве маркеров удобно использовать одноцепочечную ДНК фага и двух-цепочечную ДНК. Увеличение при электронной микроскопии можно откалибровать по стандартной выпускаемой промышленностью решетке (Ted Pella, Inc.).

Длину ДНК на фотографических негативах измеряют при помощи увеличительного стенда (электронные планиметры фирм Numonic или Hewlett-Packard) или навесных проекционных систем (фотоувеличитель). Иногда пользуются ручным курвиметром, но это более трудоемко.

Рекомендации по определению гомологии ДНК с помощью электронной микроскопии

1. Необходимо соблюдать чистоту. Пристающие к поверхности вещества, такие, как детергенты, масляные пары и оставляемый пальцами жир, мешают формированию монослоя и равномерному распределению белка. Не следует допускать загрязнения этими веществами оборудования, посуды или растворов.

2. Трис, уранилацетат, Ыа2-ЭДТА и парлодий нужно хранить в эксикаторе. Все реактивы должны быть химически чистыми. Перечисленные ниже растворы следует стерилизовать фильтрованием: 1 М трис, 0,1 М Na2-ЭДТА, 1,8 М трис-НС1, 0,2 М трис, 0,1 М NaOH и 0,02 М №2-ЭДТА. Для приготовления исходного концентрированного раствора уранилацетата делают 5* 10—3 М раствор уранилацетата в 10 мл 0,05 н. НС1 и стерилизуют его фильтрованием. Для окрашивания концентрированный раствор разводят в 100 раз 90%-ным этанолом. Концентрированный раствор хранят только 1 нед, а разведенный раствор для окрашивания — лишь в течение нескольких часов.

3. Формамид (HCONH2) гидролизуется с образованием формиата аммония, который в свою очередь дает аммиак и муравьиную кислоту. Происходящие при этом изменения ионной силы в растворах верхней и нижней фаз могут приводить к неполному расправлению одно-цепочечной ДНК. Аммиак может испаряться, приводя к быстрому снижению рН. Вследствие этого водные растворы формамида следует использовать в первые 15 мин после смешивания. Формамид фирмы Mallincrodt с 99%-ным содержанием можно использовать непосредственно без очистки; реактивы худшего качества предварительно должны очищаться. Чистоту реактива можно определить измерением оптической плотности при 270 нм, которая должна быть <0,2. Очистку формамида проводят перекристаллизацией следующим методом: оставляют формамид в запечатанной бутыли или колбе при 0°С (запечатывание предотвращает поглощение воды) до тех пор, пока 7з—хк его не закристаллизуется; кристаллы отделяют фильтрованием в холодной комнате или центрифугированием при 0°С.

4. Растягивание монослоев проводят в пластмассовых чашках Петри диаметром 50 мм. Во время растягивания чашки фиксируют липкой лентой.

5. Предметные стекла моют и хранят в хромпике, а перед использованием тщательно промывают дистиллированной или бидистиллированной водой. После использования их ополаскивают водой и кладут опять в хромпик.

6. Для приготовления сеток, покрытых парлодием, растворяют высушенный в сушильном шкафу при 60°С парлодий (пироксилин, Mallincrodt) в изоамилацетате или амилацетате до концентрации 3,5%. Для лучшего растворения смесь перемешивают, но не встряхивают и затем добавляют в нее поглотители воды. Сетки покрывают парлодием следующим образом.

а) Помещают на подставку, лежащую на дне перекрытой воронки Бюхнера, решетку из стальной проволоки. Воронку наполняют

бидистиллированной водой и укладывают сетки на эту решетку. Для

обычной работы подходят медные сетки с размером ячейки 200 меш

(Е. F. Fullam, Inc.). Важно, чтобы все сетки были расположены

одинаково: все либо матовой, либо блестящей стороной вверх,

б) Очищают водную поверхность, добавляя несколько капель

раствора парлодия и удаляя бумагой образовавшуюся пленку, после

того как она высохнет.

в) Получают пленку из одной капли раствора парлодия. Накрывают вороику оберточной бумагой Saran и ждут около 3 мин, пока

блестящая парлодиевая пленка не образует у краев воронки широкие

складки. Медленно спускают воду, чтобы пленка опустилась на сетки. С задней стороны решетки, на которой лежат сетки, убирают

избыток воды и кладут ее вместе с покрытыми парлодием сетками

в сушильный шкаф с температурой 60 °С на 45 мин. Если пленка

приготовлена правильно, оиа кажется серебристой.

7. Приводим адреса некоторых поставщиков электронно-микроскопического оборудования и реактивов:

Е. F. Fullam, Inc., Р. О. Box 444, Schenectady, NY 12301(518/785-5533)

Numonics, P. O. Box 444, North Wales, PA 19454 (215/643-7410)

Ted Pella, Inc., P. O. Box 510, Tustin, CA 92680 (714/557-9434)

15.4. ЛИТЕРАТУРА

1. Boyer H. W, Restriction and modification of DNA: enzyme substrates. Fed. Proc, 33, 1125—1127 (1974).

2. Chakrabarty A. M. Plasmids in Pseudomonas. Annu. Rev. Genet., 10, 7—30 (1976).

3. Clayton D. A„ Davis R. W., Vinograd J. Homology and structural relationships between the dimeric and monomeric circular forms of mitochondrial DNA from human leukemic leukocytes. J. Mol, Biol., 47, 137—153 (1970).

4. Clewell D. В., Helinski D. R. Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular form. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 62, 1159—1166 (1969).

5. Clowes R. C. Molecular structure of bacterial plasmids. Bacteriol. Rev., 36, 361—405 (1972).

6. Crosa J. H., Brenner D. J., Falkow S. Use of a single-strand specific nuclease for analysis of bacterial and plasmid deoxyribonucleic acid homo- and heteroduplexes. J. Bacteriol., 115, 904—911 (1973).

7. Crosa J. H., Luttropp L. /(., Heffron F., Falkow S. Two replication initiation sites on R-plasmid DNA. Mol. Gen. Genet., 140, 39—50 (1975).

8. Crosa J. H., Olarte J., Mata L. J., Luttropp L. K., Penoranda M. E. Characterization of a R-plasmid associated with ampicillin resistance in Shigella dysenteriae type 1 isolated from epidemics. Anti-microb. Agents Chemother., 11, 553—558 (1977).

9. Currier Т. C, Nester E. W. Isolation of covalently closed circular DNA of high molecular weight from bacteria. Anal. Biochem., 76, 431—441 (1976).

10. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria. Plasmid, 1, 584—588 (1978).

11. Finkelstein M., Rownd R. H. A rapid method for extracting DNA from agarose gels. Plasmid, 1, 557—562 (1978).

12. Grindley N. D. F.t Humphreys G. O., Anderson E. S. Molecular studies of R-factor compatibility groups. J. Bacteriol., 115, 387—398 (1973).

13. Querry P., LeBlanc D. J., Falkow F. General method for the isolation of plasmid deoxyribonucleic acid. J. Bacteriol., 116, 1064—1066 (1973).

14. Hansen J. В., Olsen R. H. Isolation of large bacterial plasmids and

characterization of the P2 incompatibility group plasmids PMG1 and PMG5. J. Bacteriol.. 135, 227—238 (1978).

15. Helinskl D. R. Plasmid determined resistance to antibiotics: molecular properties of R-factor. Annu. Rev. Microbiol., 27, 437—470 (1973).

16. Hirt B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J. Mol. Biol., 26, 365—369 (1967).

17. Humphreys G. 0., Willshaw G. A., Anderson E. S. A simple method for the preparation of large quantities of pure plasmid DNA. Biochim. Biophys. Acta, 383, 457—463 (1975).

18. Kleinschmidt A. K. Monolayer techniques in electron microscopy. Methods

страница 28
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)