Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

4, свидетельствует о четком разграничении фракций плазмидной ДНК с большей плотностью и хромосомной ДНК с меньшей плотностью.

7. Освобождают ДНК от бромистого этидия, экстрагируя препарат не менее четырех раз изопропанолом, насыщенным хлористым цезием.

8. Диализуют препарат ДНК против соответствующего буфера, чтобы удалить хлористый цезий.

9. Разделяют очищенную плазмидную ДНК на несколько порций и хранят при —20 °С.

Метод лизирования клеток с последующим центрифугированием в градиенте плотности можно использовать для выяснения вопроса о том, содержит ли данный бактериальный штамм плазмидную ДНК. Правда, данный метод требует дорогостоящего оборудования и больших затрат времени, к тому же с его помощью можно проверить одновременно лишь относительно небольшое число культур. Однако это лучший метод очистки плазмидных ДНК в количествах, достаточных для дальнейшего анализа.

Некоторые рекомендации по поводу центрифугирования в градиенте плотности.

1. Чтобы полностью устранить загрязнение хромосомной ДНК (верхняя полоса в градиенте, рис. 15.3), проводят вторичное центрифугирование собранной плазмидной ДНК в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием. Собирают плазмидную ДНК, вновь образовавшую полосу, с помощью раскапывания градиента со дна стакана или шприцем, проколов иглой стенку стакана.

2. Бромистый этидий добавляют после CsCl, так как релаксирующие белки, которые присутствуют в некоторых плазмидах и образуют одноцепочечные разрывы в ДНК, могут активироваться бромистым этидием [20]. CsCl в высокой концентрации (7 М) инактивирует релаксационные белки [20] в плазмидах, благодаря чему можно получить больший выход ДНК.

3. Одноцепочечные разрывы плазмидной ДНК даже при высоких концентрациях соли может вызывать видимый свет (в присутствии бромистого этидия), поэтому все операции должны проводиться в отсутствие прямого освещения.

4. Формирования четких полос и хорошего разделения плазмидной и хромосомной ДНК можно достичь центрифугированием в течение ночи в роторе Beckman № 65 со скоростью 45 000 об/мин при 15 °С. Разработанные недавно новые модели роторов позволяют разделять плазмидную и хромосомную ДНК еще быстрее.

ЧАСТЬ Ш. ГЕНЕТИКА

Определение числа плазмидных копий

Мисло копий какой-либо плазмиды, приходящееся на одну хромосому, представляет собой характеризующий плазмиду параметр, который дает информацию о способе ее репликации.

Число плазмидных копий можно установить центрифугированием меченного 3Н-тимином клеточного лизата в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием. Для подсчета числа копий используют приводимое ниже отношение между плазмидным и хромосомным пиками:

тт „ Радиоактивность (имп/мин) плазмидного пика MWX

ЧИСЛО КОПИИ =т~ j { 7Т7ТГ.

Радиоактивность (имп/мин) хромосомного пика MWn

где MWX и MWn — молекулярные массы хромосомы и плазмиды соответственно.

Для тиминзависимого штамма в ростовую среду к соответствующему количеству тимина добавляют 3Н-тимин (7 мкКи/мл). Для тиминнезависимого штамма в ростовую среду добавляют 1 мкг/мл тимина, 250 мкг/мл дезоксиаденозина и 7 мкКи/мл 3Н-тимина.

Методика включает следующие операции.

1. Выращивают культуру (1 мл) штамма, содержащего плазмиду, при 37 °С в присутствии 7 мкКи/мл 3Н-тимина до плотности, равной 2-108 клетка/мл.

2. Клетки осаждают центрифугированием, промывают их в ТЭ-буфере (0,01 М трис-НС1, 0,001 М ЭДТА, рН 8,1) и ресуспендируют в 400 мкл 0,5 М сахарозы (высокоочищенная, не содержащая рибонуклеазы сахароза в 50 мМ трисе, рН 8,0).

3. К суспензии клеток добавляют 0,2 мл 0,2 М ЭДТА, рН 7,8, и хорошо перемешивают.

4. Добавляют 0,2 мл 1%-ного лизоцима (в 0,25 М трисе, рН 8,0) и хорошо перемешивают. Немного встряхивают и ставят в лед на 15 мин.

5. Добавляют к суспензии 1,2 мл 1,2%-ного сарко-зила, после чего немедленно вносят 0,1 мл проназы (1 мг/мл) в 0,01 М трисе, 0,02 М ЭДТА, рН 8,1. Прона-зу следует предварительно проинкубировать 2 ч при 37 °С для самопереваривания, а затем прогреть перед использованием 2 мин при 80 °С. Смесь осторожно пе

ремешивают и инкубируют при 37 °С до тех пор, пока суспензия полностью не просветлится.

6. Быстро набирают и выдувают обратно раствор ДНК 5-мл пипеткой (для получения фрагментирован-ной хромосомной ДНК), пока раствор не перестанет быть вязким.

7. Центрифугируют 5 мл образца ДНК с радиоактивностью около 500 000 имп/мин в цезий-этидиевом градиенте. В данном случае показатель преломления должен быть на 0,0025 меньше, чем в случае градиента для тритонового лизата. Центрифугируют также образец ДНК в линейном градиенте сахарозы (от 5 до 20%).

8. Раскапывают градиенты по дискам фильтровальной бумаги Whatman ЗММ.

9. Осаждают радиоактивною ДНК холодной 5%-ной ТХУ, содержащей 50 мкг/мл тимина, промывают фильтры 95%-ным этанолом и высушивают. Радиоактивность измеряют в сцинтилляционном счетчике.

На рис. 15.4 изображен профиль радиоактивности разделенной в цезий-этидиевом градиенте общей клеточной ДНК из штамма Е. coli, содержащего плазмиду.

Рекомендация по определению числа плазмидных копий

1. В одном и том же градиенте можно выявить как ковалентно замкнутые кольцевые молекулы ДНК (КЗК-ДНК), так и отличные от них плазмидные открытые кольцевые молекулы ДНК (ОК-ДНК). Они разделяются в цезий-этидиевом и сахарозном градиентах. Например, димеры двух КЗК-молекул ДНК мигрируют вместе с мономерами КЗК-ДНК в цезий-этидиевом градиенте, а в сахарозном градиенте осаждаются порознь. Димеры, состоящие из одной КЗК- и одной ОК-молекулы, в цезий-этидиевом градиенте дают полосу в промежуточном положении между мономерами КЗК-и ОК-молекулами. Димеры двух ОК-молекул ДНК мигрируют в цезий-этидиевом градиенте вместе с мономерами ОК-ДНК, но дают отдельную от них полосу в градиенте сахарозы.

2. Градиенты сахарозы можно готовить при помощи градиентной смесительной камеры. Другой способ заключается в приготовлении раствора сахарозы с концентрацией, средней между крайними концентрациями желаемого градиента с последующим замораживанием его при —20 °С. Если такой раствор медленно оттаивает в течение ночи при 4°С, то при этом получается подходящий для аналитических целей градиент. Например, замороженный раствор 12,5%-ной сахарозы после оттаивания даст градиент приблизительно от 5 до 20%.

15.3.4. Выявление гомологии

(с использованием эндонуклеазы, специфически расщепляющей одноцепочечную ДНК)

Основой для любого изучения гомологии является диссоциация двухцепочечной плазмидной ДНК и последующий специфический отжиг одноцепочечной ДНК из гомологичного или гетерологичного источника (реассо-циация ДНК). Плазмидные гомо- и гетеродуплексы анализируют с помощью специфичной по отношению к одноцепочечной ДНК эндонуклеазы S1 из Aspergillus огу-zae. Приводимая ниже методика [6] позволяет точно и быстро определять, насколько гомологичны или гетеро-логичны полинуклеотидные последовательности. Это особенно полезно для проведения экспресс-анализов и для других исследований, в которых требуется постановка большого числа проб на гибридизацию ДНК — ДНК.

В качестве стандарта используют очищенную радиоактивно меченную ДНК, которую гибридизуют с очищенной суммарной клеточной ДНК из штаммов, содержащих плазмиды. ДНК какого-либо штамма, не содержащего плазмиды, служит контролем. Для проведения реакций реассоциации ДНК — ДНК, оцениваемых методом с применением эндонуклеазы S1, фрагментирован-ную денатурированную очищенную плазмидную ДНК с радиоактивностью 5000—10 000 имп/мин (обычно это меньше 0,001 мкг ДНК) инкубируют со 150 мкг нефрак-ционированной суммарной фрагментированной денатурированной бактериальной ДНК из штаммов, содержащих и не содержащих плазмиды, в 0,42 М NaCI в общем объеме 1 мл. Такие смеси инкубируют при температуре, которая зависит от суммарного процентного содержания гуанина и цитозина (G + C) в плазмидной ДНК. В случае гомологии реассоциация осуществляется фактически полностью. Время, необходимое для полной реассоциа-ции плазмидной ДНК, представляет собой функцию ее молекулярной массы и концентрации ионов. Время ре-ассоциации определяют, вычисляя значение C0Јi/2, где Со — начальная концентрация ДНК, ti/2— время достижения 50%-ной реассоциации ДНК (при концентрации С0) для данной температуры, концентрации соли и размера фрагментов ДНК. Эмпирическая формула [7] имеет вид

Р . Молекулярная масса плазмидной ДНК

Время инкубации, требуемое для получения полной реассоциации в присутствии 0,42 М NaCl, равно приблизительно 8 C0fi/2. Таким образом,

где С0 — начальная концентрация плазмидной ДНК (которую можно вычислить или оценить, исходя из числа копий плазмиды), a tx — время реассоциации.

В оптимальных условиях при инкубации только одной меченой плазмидной ДНК реассоциация цепей этой ДНК друг с другом (самореассоциация) должна составлять менее 10%, в то время как в присутствии гомологичной ей немеченой ДНК реассоциировать должно более 85%. В каждом эксперименте измеряют также реас-социацию меченой плазмидной ДНК с ДНК не несущих плазмид бактериальных клеток и вычитают величину этой реассоциации (около 10% или меньше) из величин реассоциации, определенных для каждой реакции.

Гибридизация

1. Смесь для реассоциации: 150 мкг немеченой, обработанной ультразвуком суммарной клеточной ДНК; меченая обработанная ультразвуком плазмидная ДНК с радиоактивностью 5000—10 000 имп/мин; NaCl в количестве, достаточном для создания концентрации 0,42 М в общем объеме 1,0 мл.

2. ДНК денатурируют кипячением в этой смеси в течение 10 мин и затем раствор ДНК помещают в лед.

3. Инкубируют смесь для реассоциации при температуре 55—70 °С, зависящей от процентного содержания G-fC в плазмидной ДНК.

Плазмидную ДНК, меченную 3Н-тимином, выделяют в виде КЗК-ДНК методом, в котором для лизиса клеток используется тритон (разд. 15.1.2). Можно также ДНК пометить in vitro. Удельная активность меченной 3Н-ти-мином ДНК, получаемой этим методом, обычно составляет ~ 106 имп/мин/мкг. Эту плазмидную ДНК подвергают обработке ультразвуком, чтобы получить фрагменты с мол. массой ~2,5-105.

Суммарную клеточную ДНК

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.08.2019)