Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

ть их при —20 °С.

15.3.2. Гель-электрофорез

Рестриктаза катализирует расщепление двухцепочеч-ной ДНК в специфических сайтах узнавания [1, 29], причем места расщепления в разных цепях смещены относительно друг друга. В случае фермента EcoRl, например, специфическая нуклеотидная последовательность, которую он узнает, выглядит так:

\

GAATTC CTTAAG, t

где стрелки указывают места расщепления. Плазмидная ДНК (как и любая другая в этом отношении) после обработки эндонуклеазой дает характерный набор фрагментов, зависящий от числа и расположения в геноме специфических сайтов узнавания. Эти фрагменты разделяют электрофорезом в агарозном геле. Сравнение картин разделения фрагментов, полученных из разных плазмид, позволяет качественно оценивать степень их родства. Фрагменты ДНК можно также перенести из ага-розного геля на полоску нитроцеллюлозы (перенос материала из геля на бумагу называется блоттингом), а если провести их гибридизацию с радиоактивно меченным образцом ДНК, можно выявить фрагменты, содержащие последовательности, гомологичные последовательностям образца; гомологичные фрагменты выявляются при радиоавтографии в виде резких полос на нит-роцеллюлозной полоске [28].

К настоящему времени описано около 150 различных рестриктаз; некоторые из них производятся в промышленных масштабах (Bethesda Research Laboratory, Rock-ville, MD 20850; Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN 46514; New England Biolabs, Beverly, Ma 01915). Для оптимального функционирования каждой рестриктазы нужны особые условия, которые обычно указываются

Рис. 15.2. Наборы полос, получаемые при обработке плазмид Арг из разных энтеробактерий рестриктазой Hinc [8]. Обработку и электрофорез проводили, как описано в разд. 15.3 2. Гель окрашивали бромистым этидием. Картина люминесценции, возникающая в результате иитеркаляции красителя при освещении ультрафиолетом, сфотографирована на пленку «Поляроид».

изготовителем. Полезность анализа с применением рест-риктаз мы проиллюстрируем на следующем примере.

Кроза и др. [8] исследовали ряд устойчивых к ампициллину штаммов, относящихся к 1-му типу Shigella dysenteriae, которые были выделены во время разных эпидемий. Во всех случаях детерминанта устойчивости к ампициллину принадлежала плазмиде с мол. массой 5,5-106. На рис. 15.2 показаны картины разделения фрагментов плазмидной ДНК, полученных после обработки рестриктазой Hinc II. Во всех пробах была обнаружена сходная плазмидная ДНК с мол. массой 5,5-106. Такой результат свидетельствует о том, что изучаемые плазмиды гомологичны.

Для расщепления плазмидной ДНК рестриктазой Nine II использовали следующую методику.

1. Обрабатывали 20 мкл очищенной плазмидной ДНК ( — 0,2 мкг ДНК) в буфере (10 мМ трис-HCl, 50 мМ NaCI, 6 мМ 2-меркаптоэтанол, 6 мМ MgCl2, рН 7,0) рестриктазой Hinc II (New England Biolabs; 2000 ед. акт./мл), которую добавляли в количестве 2 ед. акт.

2. Реакционную смесь инкубировали 90 мин при 37 °С.

3. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл водного раствора 0,07%-ного бромфенолового синего, 7%-ного ДСН и 33%-ного глицерина.

4. Проводили электрофорез всей реакционной смеси в 0,7%-ном агарозном геле, как описано в разд. 15.3.1.

5. Сравнивали картины полос фрагментов после окрашивания бромистым этидием (разд. 15.3.1).

В некоторых случаях крайне желательно экстрагировать разделенные в агарозном геле фрагменты. Они могут понадобиться для исследования химическими и физическими методами, а также для установления деталей структуры рестрикционным анализом, определения последовательности оснований в ДНК, гетеродуплексно-го анализа и гибридизации с использованием эндонук-леазы [6] или блоттинга методом Саузерна [28]. Приводимая ниже методика [11] позволяет экстрагировать с хорошим выходом всевозможные интактные, биологически активные молекулы ДНК непосредственно из полос, которые они образуют в агарозном геле. Для осуществления этой операции нужен выпускаемый промышленностью препарат агаразы (Calbiochem, La Jolla, Calif., номер по каталогу 121811)—фермента, расщепляющего агарозу.

1. Гидролиз эндонуклеазой и электрофорез в агарозе с окраской бромистым этидием (разд. 15.3.1) описаны выше. Фрагменты ДНК, разделенные в 0,6%-ном агарозном геле (трубочка диаметром 0,6 см и длиной 11 см), выявляют в ультрафиолете, а диски геля с этими фрагментами вырезают бритвенным лезвием. Можно одновременно обрабатывать несколько вырезанных дисков (по 0,05—0,1 г каждый) с одним и тем же фрагментом.

2. Разрушают диск геля в 0,1 М трисе, рН 5,95 (0,1 мл на диск). Суспензию гомогенизируют, набирая и выпуская ее трижды пластмассовым шприцем (без иглы) объемом 1 мл в центрифужный стакан из пирекса.

3. Добавляют раствор агаразы (50 мкг на диск) в 0,1 М трис-HCl, рН 5,95 (концентрация фермента 1 мг/мл), и инкубируют 2 ч при 37°С.

4. Удаляют агарозу центрифугированием при 48 000 g в течение 30 мин при 4°С.

5. При необходимости надосадочную жидкость, содержащую ДНК, можно сконцентрировать осаждением двумя объемами этанола или диализом против полиэти-ленгликоля.

6. Перед концентрированием проводят дополнительную очистку препарата пропусканием надосадочной жидкости через фильтр Swinnex (Millipore Corp., Bedford, Mass.) с размером пор 0,45 мкм.

При получении ДНК этим методом выход составляет ~75—80% для плазмидной ДНК с мол. массой 7,4-*106—60-Ю6 и для фрагментов, полученных под действием рестриктазы Eco RI с размерами от 0,75* 106 до 13,9-106. ДНК, экстрагируемая с помощью агаразы, вызывает трансформацию фактически с той же частотой (для клеток Е. coli), что и ДНК, не контактировавшая с этим ферментом. Извлеченные из гелей фрагменты ДНК с успехом использовались в экспериментах по клонированию в качестве источника или носителя генетической информации [11].

15.3.3. Центрифугирование в градиенте плотности

(с использованием бромистого этидия)

Молекулы плазмидной ДНК, полученные из клеток бактерий, представляют собой двухцепочечные кова-лентно замкнутые кольцевые структуры, не имеющие свободного конца, вокруг которого они могли бы раскручиваться. Бромистый этидий, относящийся к ряду фенатридиновых красителей, связывается с ДНК и РНК и тормозит функционирование нуклеиновых кислот [5, 15]. Клетки лизируют и лизаты наносят на градиенты хлористого цезия, содержащие бромистый этидий. При высокоскоростном центрифугировании ДНК седиментиРис. 15.3. Результат центрифугирования бактериального лизата, полученного при добавлении тритона Х-100, в цезий-этидиевом градиенте. При освещении ближним ультрафиолетовым светом видны две полосы люминесценции интеркалировавшего в ДНК бромистого этидия. Верхняя полоса соответствует хромосомной ДНК, нижняя — плазмидной ДНК.

Таблица 15.2. Компоненты смеси, добавляемые при центрифугировании в цезий-этидиевом градиенте плотности

Тип ротора

Состав пробы

50 Ti-GO

Лизат 3,2 мл 24 мл

ТЭН-буфер 2,0 мл 3 мл

CsCl 4,9 г 23 г

Бромистый этидий 0,2 мл 1 мл

рует до установления равновесия. Встраиваясь в молекулу ДНК, бромистый этидий уменьшает ее плотность [3, 25]. Линейная молекула ДНК или разомкнутая кольцевая (с разрывом в одной цепи) молекула плазмидной ДНК не имеет тех физических ограничений, которые характерны для ковалентно замкнутой кольцевой (КЗК) плазмидной ДНК. Вследствие этого первые ДНК связывают значительно больше молекул бромистого этидия и их плотность становится меньше, чем плотность КЗК-ДНК. Эта разница в связывании красителя позволяет разделять разные формы плазмидной ДНК. В градиентах хлористого цезия формы с встроенным бромистым этидием благодаря люминесценции последнего могут быть визуально зафиксированы в ультрафиолетовом свете в виде дискретных полос (рис. 15.3).

Для осуществления методики, приведенной ниже, требуются препаративная ультрацентрифуга, переносной источник ультрафиолетового света (Black Ray, UVL-22; Ultraviolet Products, Inc., San Gabriel, Calif.), градиентатор и рефрактометр (Abble 3L, Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY). Материал, выделенный с помощью тритона Х-100 (разд. 15.1.2), можно, к примеру, обработать следующим образом.

1. В полиалломерный центрифужный стакан размером 1,6X7,6 см центрифуги Beckman вносят 5 г хлористого цезия, 2 мл буфера ТЭН и 3,2 мл клеточного лизата.

2. Перемешивают содержимое стакана до полного растворения хлористого цезия и добавляют 0,2 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл в ТЭН-буфере).

3. Измеряя показатель преломления раствора, доводят его плотность до 1,3925±0,001 г/см3 добавлением ТЭН-буфера или сухого хлористого цезия. Показатель преломления измеряется с ошибкой и может быть разным при измерении разными приборами, поэтому рекомендуется в пробных экспериментах стандартизировать измерения. При необходимости в стаканы доливают минеральное масло.

4. Подготавливают стаканы к ультрацентрифугированию, согласно предписанию фирмы-изготовителя, и ставят их в соответствующий ротор. Стаканы должны быть хорошо уравновешены.

В соответствии с объемом лизата можно использовать полиалломерные стаканы любого размера. Например, при крупномасштабном выделении с использованием тритона получают 20 мл лизата, которые можно центрифугировать в полиалломерном стакане для ротора Beckman Ti-60. А если объем лизата около 10 мл, то можно провести центрифугирование в полиалломерном стакане для 65-го ротора (Beckman). В табл. 15.2 указаны различные соотношения буфера ТЭН, хлористого цезия и бромистого этидия.

5. Центрифугирование проводят со скоростью

40 000 об/мин при 15 °С в течение по крайней мере 44 ч

в препаративной ультрацентрифуге Beckman (или какой-либо аналогичной ей). После центрифугирования просматривают стаканы с градиентами в ультрафиолете в поисках полос, люминесцирующих благодаря образованию комплексов ДНК с бромистым этидием. Отбирают плазмидную ДНК (нижняя полоса в градиенте на рис. 15.3) через дно стакана, пользуясь каким-либо прибором для фракционирования градиентов.

6. Когда в опыт берут радиоактивный препарат ДНК, фракции проверяют на радиоактивность. Типичный профиль распределения радиоактивности, показанный на рис. 15.

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.05.2019)