Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

ин G из расчета 1 мг/мл и еще 2 ч инкубируют культуру при оптимальной для роста температуре. (Имеет смысл провести предварительные опыты, в которых следует определить время и концентрацию антибиотика, оптимальные для образования протопластов; целью при этом является максимальный выход протопластов при незначительном разрушении клеток. В данном случае может быть полезным добавление к ростовой среде 1 М сахарозы.)

2. Клетки, обработанные пенициллином, собирают центрифугированием, как и в предыдущих случаях, и дважды промывают их равными объемами 0,01 М трис-НС1, рН 8,2.

3. Клеточный осадок суспендируют в 0,25 объема 0,02 М триса, рН 8,2, 0,5 объема 1 М сахарозы и 0,25 объема раствора лизоцима (4 мг/мл) в 0,02 М трисе, рН 8,2.

4. Инкубируют клеточную суспензию в течение 1 ч

при 37 °С на качалке.

5. Центрифугируют ее при 27 000 g в течение 15 мин.

6. Осторожно суспендируют клетки в 0,02 М трисе, 0,01 М ЭДТА, рН 8,2, позаботившись о том, чтобы клетки в суспензии распределились равномерно.

7. Добавляют к суспензии 0,1 объема 10%-ного ДСН. Лизис должен завершаться в течение 10 мин. Дальнейшие операции проводят так же, как в методе с применением ДСН (разд. 15.1.3).

15.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК С БОЛЬШОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ

Предложенные выше методы имеют ограничение: они годятся только для тех плазмидных ДНК, молекулярная масса которых не превышает 100-106. В то же время для ряда бактериальных систем известны большие плазмиды, такие, как вызывающие образование опухолей растений плазмиды Agrobacterium tumefaciens [30], плазмиды, детерминирующие устойчивость к антибиотикам и относящиеся к группе несовместимости и [12], плазмиды Pseudomonas putida, ответственные за разрушение камфоры [2, 24], а также разнообразные F-фак-торы [22, 26, 27]. В последнее время разработано несколько методов, позволяющих наряду с плазмидами небольшого размера выделять и эти большие плазмиды [9, 14, 17, 30]. Созданы также методы, дающие возможность работать с очень маленькими объемами или даже с материалом единственной колонии [10].

Метод, описываемый ниже, недавно разработали Портной и Уайт (личное сообщение). Его преимущество заключается в малых рабочих объемах; к тому же ему присущи лучшие стороны ранее опубликованных методик.

В этом методе используется та особенность плазмидной ДНК, что ее цепи не расходятся под воздействием щелочи. Когда клетки разрушают в щелочных условиях, выход плазмидной ДНК с большой молекулярной массой (до 350• 106) улучшается. В настоящее время мы используем этот метод, ставший стандартным, для выявления плазмид в любой культуре бактерий.

Данный метод был успешно применен нами при выделении плазмид как из грамотрицательных бактерий (например, Agrobacterium tumefaciens, Yersinia eniero-colitica, Salmonella typhi, Klebsiella sp., E. coli), так и из грамположительпых (например, Staphylococcus sp., и Streptococcus sp.). Как и при использовании других методов, мы заметили, что для морских вибрионов и для галофильных бактерий необходимы этапы промывки высококонцентрированными солевыми растворами (до 1 М NaCI).

Плазмидная ДНК, полученная этим методом даже из 2 мл культуры, практически не содержит хромосомной ДНК, и после проведения немногочисленных дополнительных этапов ее можно непосредственно использовать для анализа с помощью трех рестриктаз (разд. 15.3.1). Целиком все операции метода с дополнениями проводят следующим образом.

1. Выращивают в течение ночи 2 мл культуры в соответствующей среде (например, в сердечно-мозговом бульоне) на качалке в пробирках высотой 120 мм с завинчивающимися крышками. Для последующей обработки используют выросшие клетки или получают из них популяцию в логарифмической фазе роста, для чего культуру разводят 1 : 20 в 2 мл свежей среды и инкубируют ее дополнительно в течение 2—3 ч. Клетки собирают центрифугированием в течение 10 мин в настольной центрифуге Sorvall при 2500 g.

2. Ресуспендируют клетки в 2 мл буфера ТЭ (0,05 М трис-НС1, 0,01 М ЭДТА, рН 8,0), повторяют центрифугирование и тщательно ресуспендируют клеточный осадок в 40 мкл буфера ТЭ.

3. Не ранее чем за сутки готовят лизирующий буфер (4% ДСН в буфере ТЭ, рН 12,4). Важно точно измерить рН, так как при рН 12,5 происходит необратимая денатурация плазмидной ДНК. Наливают в 1,5-мл центрифужную пробирку (производятся фирмой Brinkmann Instruments; номер по каталогу 22-36-911-1) 0,6 мл ли-зирующего буфера, после чего пастеровской пипеткой вносят туда же 40 мкл клеточной суспензии. Суспензию хорошо перемешивают, не прибегая к помощи специальных перемешивающих устройств и избегая сильного взбалтывания. (Чтобы лишний раз не переносить КУЛЬтуру, ее можно выращивать непосредственно в 1,5-мл центрифужной пробирке.)

4. Для полного лизиса клеток суспензию инкубируют в течение 20 мин при 37 °С.

5. Нейтрализуют раствор добавлением 30 мкл 2,0 М триса, рН 7,0. Перемешивают его, медленными движениями переворачивая пробирку до тех пор, пока не станет изменяться вязкость раствора.

6. Хромосомную ДНК осаждают внесением такого количества NaCl (около 0,24 мл 5 М NaCl), чтобы создать в растворе конечную концентрацию 1 М. Это делают очень быстро. Для полного осаждения хромосомной ДНК пробирку ставят в лед на 4 ч. Если обследуется большое число культур и не нужно заботиться об особой чистоте плазмид, это время можно сократить до 1 ч.

7. С помощью микроцентрифуги (например, модель Eppendorf 5412) за 10 мин осаждают посторонний материал и переливают надосадочную жидкость в другую 1,5-мл пробирку (не следует стараться, чтобы на дне первой пробирки осталось как можно меньше жидкости) .

8. Для осаждения ДНК добавляют к надосадочной жидкости 0,55 мл изопропанола. После перемешивания пробирку оставляют при —20РС на 30 мин.

9. ДНК осаждают центрифугированием в течение 3 мин на микроцентрифуге, надосадочную жидкость выливают, пробирку в перевернутом положении ставят на бумажную салфетку и затем ее содержимое высушивают под вакуумом.

10. Осадок суспендируют в 30 мкл буфера ТЭН (0,05 М

трис, 0,005 М ЭДТА, 0,05 JA NaCl, рН 8,0). ДНК растворяется в течение ночи при 4°С. Обычно при электрофорезе (100 В, 3 ч) 10 мкл этого раствора в 0,7%-ной

агарозе с применением трис-боратной буферной системы получают хорошо видимые полосы ДНК.

Для анализа плазмидной ДНК рестриктазным расщеплением ее подвергают дальнейшей очистке (разд. 15.3.2) на следующих дополнительных этапах.

11. Полученный на 9-м этапе осадок суспендируют в

100 мкл 0,01 М триса, рН 8,0, добавляют 100 мкл фет

нола, насыщенного 0,01 М трисом, рН 8,0, хорошо перемешивают и добавляют 100 мкл хлороформа.

12. Разделяют водную и фенол-хлороформную фазы центрифугированием в течение 30 с на микроцентрифуге. Водную фазу отбирают 100-мкл микропипеткой, стараясь не захватить слой, находящийся между фазами.

13. Плазмидную ДНК осаждают двумя объемами 95%-ного охлажденного во льду этанола и дальше действуют, как на 9-м этапе. Полученный осадок растворяют в буфере для соответствующей рестриктазы.

15.3. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

15.3.1. Электрофорез в геле

Для выявления и предварительной характеристики ДНК плазмид, присутствующих в клиническом материале или лабораторных штаммах грамотрицательных и грамположительных бактерий, подходят обычные методы электрофореза в геле с незначительными модификациями [10, 23]. Метод выделения плазмид с ДСН (разд. 15.1.3) широко применяется в сочетании с анализом ДНК гель-электрофорезом [26]. При этом, однако, в частично очищенных клеточных лизатах могут быть выявлены лишь те плазмиды, молекулярная масса которых лежит в пределах от 0,6-105 до 100-106. Мы же используем метод, описанный в разд. 15.2, который позволяет выявлять плазмиды с мол. массой от 0,6-106 до 350* 106.

При электрофорезе плазмидной ДНК в геле расстояния, которые проходят разные виды молекул, находятся в обратной зависимости от значений их молекулярной массы. Во всех публикуемых в настоящее время методиках используются либо вертикальные, либо горизонтальные пластинки с гелем, регулируемые источники питания и источники коротковолнового ультрафиолетового света. Электрофорезу подвергают даже частично очищенные лизаты (как правило, достаточно 10— 20 мкл).

Для электрофореза используют стандартный прибор, в котором вертикально расположенная пластина с ге

лем (размеры геля 100X140X2,5 мм) имеет 12 лунок для нанесения проб (6,5x15x2,5 мм). Такой прибор можно купить (Aquebogue Machine and Repair Shop, P. O. Box 205, Aquebogue, NY 1131) или изготовить в мастерских. Концентрация агарозы (тип Seakem ME, Marine Colloids, Inc., Rockland, Maine) в геле варьирует от 0,25 до 1,5% в стандартном буфере для электрофореза: 89 мМ трис, 2,5 мМ двунатриевая соль ЭДТА и 8,9 мМ борная кислота. Электрофорез проводят обычно в течение 2 ч при комнатной температуре, напряжении 120 В и силе тока 60 мА. Затем гель помещают в раствор бромистого этидия (0,4—1,0 мкг/мл) на 15 мин, после чего ДНК выявляют в дальнем ультрафиолете.

На рис. 15.1 показана фотография одного такого геля (0,7%-ная агароза). Полоса Хр соответствует хромосомной ДНК, находящейся в частично очищенном препарате. В первом образце кроме этой полосы имеется несколько полос, соответствующих плазмидной ДНК с разными, но известными молекулярными массами из различных штаммов бактерий; эти ДНК используются в качестве стандартов. При построении графической зависимости в логарифмических координатах перемещения в геле плазмидной ДНК от молекулярной массы этой ДНК получают прямую линию в пределах от 100• • 106 до 1-Ю6. Интерполяцией можно получить значения молекулярной массы плазмид из различных бактерий.

Для определения молекулярной массы неизвестных плазмид с помощью электрофореза в агарозном геле в качестве стандартов используют плазмиды, молекулярная масса которых известна (табл. 15.1). Чтобы выявить плазмиды с большой молекулярной массой, клетки ли-зируют по методу, описанному в разд. 15.2. Для удобства рекомендуется разделять раствор плазмидной ДНК, полученный для каждого из штаммов, на порции объемом по 20 мкл и храни

страница 24
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)