Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

льтаte обработки химическими агентами), чтобы определить, теряется ли плазмида синхронно с определенной функцией клетки-хозяина.

В клинической лаборатории или в лаборатории, где изучают рекомбинантные ДНК, часто бывает важно проанализировать большое число выделяемых штаммов на содержание плазмид. В клиническом аспекте набор плазмид в клетке может служить полезным эпидемиологическим маркером, а в научно-исследовательской лаборатории часто требуется идентифицировать различные классы рекомбинантной ДНК.

15.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

15.1.1. Выделение с помощью тритона Х-100

(для Е. coli К-12)

Приводимый ниже метод [4, 19] хорошо подходит для выделения плазмидной ДНК штаммов Е. coli К-12 в том случае, если клетки лизируют неионным детергентом тритоном Х-100 (Beckman Instruments, Inc., Fuller-ton, CA, 92634).

1. Клетки выращивают при 37 °С либо в богатой питательной среде (например, в сердечно-мозговом бульоне), либо в подходящей минимальной среде в условиях слабой аэрации, достигаемой покачиванием колбы на скорости, которой едва хватает, чтобы привести в движение поверхность среды. Культуру объемом 100 мл помещают в 250-мл колбу Эрленмейера; эти величины могут быть пропорционально уменьшены или увеличены. Для получения оптимального лизиса клетки следует собирать в середине логарифмической фазы роста.

2. Суспензию с клетками центрифугируют в 250-мл стаканах (например, в течение 10 мин при 12 100 g при 5°С) в роторе GS-A центрифуги Sorvall, ресуспендируют осадок в 15 мл буфера ТЭН (0,05 трис, 0,005 М ЭДТА, 0,05 М NaCI, рН 8,0), переносят в 40-мл стакан и центрифугируют при 10 000 об/мин в течение 10 мин при 5°С в роторе SS-34 центрифуги Sorvall. Осадок ресуспендируют в 1 мл охлажденного во льду 25%-ного раствора сдхарозы (в 0,05 М трисе, 0,001 М ЭДТА, рН 8,0) и оставляют стакан во льду на 30 мин.

3. Добавляют лизоцим (0,2 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл в 0,25 М трисе, рН 8,0). Несколько раз круговыми движениями руки перемешивают содержимое центрифужного стакана и вновь оставляют его во льду на 10 мин.

4. Добавляют 0,4 мл 0,25 М ЭДТА, рН 8,0. Перемешивают содержимое и оставляют стакан во льду еще на 10 мин.

5. Добавляют 1,6 мл лизирующей смеси с тритоном Х-100 (1 мл 10%-ного тритона Х-100 в 0,01 М трисе, рН 8,0, плюс 25 мл 0,25 М ЭДТА, рН 8,0, плюс 5 мл 1 М триса, рН 8,0, плюс 69 мл воды). После очень осторожного, но тщательного перемешивания суспензии круговым движением стакан оставляют во льду на 20 мин.

6. Центрифугируют содержимое при 35 000 g в течение 20 мин при 5°С на центрифуге Sorvall или Beckman J21 (в роторе SS-34 или JA-20 соответственно).

Этим методом от основной массы хромосомной ДНК и клеточных обломков отделяется около 95% плазмид. Обогащенную плазмидами надосадочную фракцию (3,2 мл) подвергают дальнейшей очистке и концентрированию центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия в присутствии бромистого этидия (це-зий-этидиевый градиент; разд. 15.3.3).

15.1.2. Выделение с помощью тритона Х-100

(для других грамотрицательных бактерий)

Квакенбуш (личное сообщение) несколько модифицировал изложенный в предыдущем разделе метод, благодаря чему была улучшена четкость полос в агарозном геле при электрофорезе (разд. 15.3.1). Его модификация относится к лизатам некоторых бактерий, например Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Proteus retgeri и Klebsiella pneumoniae.

1. Выращивают 40 мл культуры в 100-мл колбах со встряхиванием в сердечно-мозговом бульоне (Difco Laboratories, г. Детройт, шт. Мичиган).

2. Клетки собирают центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин (в роторе SS-34 на центрифуге Sorvall).

3. Клеточный осадок суспендируют в 5 мл буфера

ТЭН (разд. 15.3.1).

4. Суспензию центрифугируют так же, как и ранее.

5. Осадок суспендируют в 2 мл 25%-ного раствора сахарозы (в 0,001 М ЭДТА, 0,05 М трисе, рН 8,0). Центрифужный стакан оставляют во льду на 20 мин.

6. Добавляют к суспензии 0,4 мл лизоцима (10 мг/мл в 0,25 М трисе, рН 8,0). Стакан оставляют во льду на 20 мин.

7. К клеточной суспензии добавляют 0,8 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0.

8. Клетки лизируют добавлением 4,4 мл тритоновой литической смеси (разд. 15.3.1) и аккуратно перемешивают.

9. Инкубируют смесь в центрифужном стакане при 65 °С в течение 20 мин.

10. Обломки клеток удаляют центрифугированием при 27 200 g в течение 40 мин (в роторе SS-34 на центрифуге Sorvall).

11. К надосадочной жидкости добавляют раствор NaCI до конечной концентрации 0,5 М и полиэтиленгли-коль (с мол. массой от 1000 до 6000) до конечной концентрации 10%, используя исходные растворы 5 М NaCI и 40%-ного полиэтиленгликоля.

12. Оставляют смесь в центрифужном стакане на ночь при 4°С.

13. Осаждают сформировавшийся осадок центрифугированием при 3000 g в течение 10 мин (в роторе SS-34 на центрифуге Sorvall) и ресуспендируют его в 1—2 мл 0,25 М NaCI, содержащего 0,001 М ЭДТА и 0,1 М трис-HCl, рН 8,0.

14. Осаждают ДНК добавлением двух объемов 95%-ного этанола при —20 °С и оставляют на ночь при -20 °С.

15.1.3. Выделение с помощью додецилсульфата натрия

Описываемый метод, разработанный Герри и др. [13], представляет собой модификацию метода Хирта [16]. Метод дает хорошие результаты для бактерий, которые лизируются детергентом додецилсульфатом натрия (ДСН). Он основан на преимущественном осаждении этим детергентом в присутствии хлористого натрия высокомолекулярной хромосомной ДНК.

1. В 100-мл колбу с исследуемым бактериальным штаммом вносят 30 мл сердечно-мозгового бульона (Difco) и выращивают культуру в течение ночи на качалке в водяной бане при 37 °С.

2. Клетки осаждают центрифугированием при 12 100 g в течение 10 мин при 4°С. Осадок ресуспендируют в 1,5 мл 25%-ной сахарозы, 0,05 М триса и 0,001 М ЭДТА, рН 8,0.

3. К клеточной суспензии добавляют 0,2 мл раствора лизоцима (10 мг/мл лизоцима в 0,25 М трисе, рН 8,0) и осторожно перемешивают. Оставляют центрифужный стакан во льду на 15 мин.

4. Добавляют 0,1 мл 0,25 М ЭДТА, рН 8,0, осторожно перемешивают и вновь ставят стакан в лед на 10 мин.

5. Добавляют 0,1 мл 20%-ного раствора ДСН. Суспензию осторожно перемешивают и оставляют во льду на 10 мин. В течение этого времени клетки лизирт ются, и раствор становится вязким.

6. Осаждают хромосомную ДНК добавлением 3 М NaCI до конечной концентрации 1 М (обычно добавляют 0,9 мл 3 М NaCI). Оставляют стакан во льду по крайней мере на 2 ч, чтобы полностью сформировался осадок. Часто удобным оказывается оставлять стакан на ночь в холодильнике.

7. Осаждают хромосомную ДНК и все клеточные обломки центрифугированием в течение 30 мин при 17 000 об/мин и температуре 4 °С, отделяют надосадоч-ную жидкость (обогащенную плазмидной ДНК), вносят ее в 15-мл пробирку из корекса.

8. Удаляют РНК добавлением одного объема дистиллированной воды и 4 мкл растворенной в 0,15 М NaCI рибонуклеазы с концентрацией 5 мг/мл (перед использованием раствор рибонуклеазы выдерживают 10 мин при 100°С, чтобы инактивировать дезоксирибонуклеазы). Пробирку инкубируют дополнительно 1 ч при 37 °С.

9. Для депротеинизации смеси добавляют равный объем насыщенного трисом фенола. Смесь энергично встряхивают и затем центрифугируют в течение 20 мин при 20 °С и скорости вращения ротора 5000 об/мин. Отбирают водную (верхнюю) фазу, содержащую ДНК, и повторяют всю процедуру еще раз.

10. Переносят водную фазу в 30-мл пробирку из ко-рекса и добавляют к ней 3 М ацетат натрия (обычно ~0,6 мл) до конечной концентрации 0,3 М.

11. Добавляют 2 объема холодного (—20 °С) 95%-ного этанола. Хорошо перемешивают и оставляют на ночь при —20 °С.

12. Выпавшую в осадок ДНК осаждают центрифугированием при 12 100 g в течение 20 мин при —10°С. Осторожно декантируют этанол и растворяют осадок ДНК в 0,2 мл 6 мМ триса, рН 7,5.

Полученную ДНК можно охарактеризовать электрофорезом в геле, центрифугированием в градиенте плотности или определением гомологичных последовательностей. Эти методы детально описаны в разд. 15.3.

15.1.4. Выделение с помощью лизостафина

Приводимая ниже методика успешно применяется для получения плазмид из грамположительных бактерий, а также из тех грамотрицательных бактерий, которые не лизируются тритоном Х-100 и ДСН.

1. Клетки выращивают до середины логарифмической фазы роста в 30 мл сердечно-мозгового бульона в колбе на качалке. Культуру центрифугируют и осадок суспендируют в 1,5 мл 0,0075 М NaCI, 0,05 М ЭДТА, рН 7,0.

2. Добавляют лизостафин (Sigma Chemical Co., St. Louis MO 63178) до конечной концентрации 15 мкг/мл. (Для Staphylococcus epidermidis концентрацию этого фермента следует удвоить.) Инкубируют суспензию в течение 15 мин при 37 °С в условиях слабого покачивания, после чего оставляют колбу во льду.

3. Добавляют 1,5 объема смеси, содержащей 0,4%-ную дезоксихолевую кислоту, 1%-ный Brij-58 и 0,3 М ЭДТА, рН 8,0, чтобы лизировать клетки. Осторожно перемешивают вязкое содержимое пробирки и оставляют ее на 15 мин во льду.

4. Осколки клеток осаждают центрифугированием при 23000 g в течение 20 мин и при температуре 4°С

(в роторе Sorvall SS-34). Надосадочную жидкость декантируют в 15-мл корексовую пробирку.

5. Добавляют в пробирку 1 объем дистиллированной воды и 4 мкл раствора рибонуклеазы (1 мг/мл). Смесь инкубируют 1 ч при 37 °С. Дальнейшую очистку ДНК проводят так же, как и в методе с применением ДСН (разд. 15.1.3).

15.1.5. Выделение с помощью пенициллина

Описываемая ниже методика может применяться для получения плазмидной ДНК грамположительных бактерий и таких грамотрицательных бактерий, которые устойчивы к тритону Х-100 и ДСН, но чувствительны к пенициллину. Если изучаемая бактерия образует р-лак-тамазу, то эффективным может оказаться антибиотик, который устойчив к ферментам, расщепляющим пенициллин (например, цефалоспорин). Мы не уверены в том, что такой же положительный результат дадут другие антимикробные агенты, активные в отношении биосинтеза клеточной стенки; эту возможность было бы полезно исследовать.

1. Выращивают бактерии до середины логарифмической фазы роста, как описано в разд. 15.1.4. Добавляют пеницилл

страница 23
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)