Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

натриевую соль, и хранят при 4 °С

г Добавлять к ЕМВ-arapy в концентрации 75 мкг/мл

Растворяют в 100% ном метаноле в концентрации 20 мг/мл, после чего раствор разводят стерильной водой до получения 2 мг/мл в 10% иом метаноле Хранят при 4 °С в темноте и каждую неделю готовят заново.

Суспендируют в стерильной воде и хранят при 4 °С

Растворы тетрациклина нестабильны, поэтому взвешенный порошок антибиотика суспендируют в стерильной воде и сразу добавляют к средам до желаемых конечных концентраций Можно также приготовить исходный концентрированный раствор и хранить его в темноте при —20 °С В связи с тем что в препаратах тетрациклина часто присутствует аскорбиновая кислота в довольно большой концентрации, следует делать необходимые поправки

ном продлевается, если они содержатся в темноте. Продукты же распада тетрациклина токсичны как для Тс5, так и для Тсг-бактерий.

14.4.9. Приготовление агаровых сред

Агар для приготовления и определения титра фаго-лизатов нужно разливать в чашки, находящиеся на выставленной по уровню горизонтальной поверхности. Выход фага и размер стерильных пятен увеличиваются, если в чашку заливают 35—40 мл агаровой среды. Важно также, чтобы агар в чашках, предназначенных для спот-теста, не был ни слишком подсохшим, ни слишком увлажненным. Качество агара улучшается, если его разливают в чашки за два дня до использования; затем оба дня или один день перед работой его выдерживают при комнатной температуре и инкубируют с закрытой крышкой 12 ч при 37 °С. Если лизат готовят из сплошного газона в чашке, агар заливают в чашки за день до опыта и не подсушивают при 37 °С.

Минимальный агар в чашках, которые часто необходимо инкубировать по двое суток, должен иметь объем ~25—30 мл. Процессы брожения на ЕМВ-агаре или агаре Мак-Конки также идут лучше, если в чашках содержится по крайней мере по 25 мл агаровой среды.

14.4.10. Хранение агаровых сред

Большинство агаровых сред, за исключением тех, которые содержат нестабильные антибиотики (табл. 14.5), можно помещать в пластмассовые мешки и хранить при 4°С в течение нескольких месяцев. Среды с красителями и другими окрашенными соединениями следует хранить в темноте. Это особенно важно для ЕМВ-агара, который, подвергшись фотоокислению, тормозит рост бактерий.

14.4.11. Поставщики штаммов бактерий и фагов

Штаммы. Е. coli. Coli Genetic Stock Center, Dr. Barbara Bachman, Department of Human Genetics, Yale University School of Medicine, 333 Cedar Street, New Haven, CN 06510.

Штаммы других бактерий и фагов. American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852.

14.5. ЛИТЕРАТУРА

14.5.1. Общая литература

1. Clowes R. С, Hayes W Experiments in microbial genetics. Black-well Scientific Publications, Oxford, 1968.

Книга немного устарела, но содержит много полезных методов и, прописей для экспериментов в области молекулярной генетики.

2. Milter J. H. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1972.

Современное и полное собрание методов и прописей для экспериментов в области молекулярной генетики и молекулярной биологии.

14.5.2. Специальная литература

3. Achtman М. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 60, 79—123 (1973).

4. Adams М. Н. Bacteriophages. Interscience Publishers, Inc., New York, 1959.

5. Bachmann B. J.t Low К. В., Taylor A. L. Bacteriol. Rev., 40, 116— 167 (1976).

6. Berg С. M., Curtiss R., III. Genetics, 56, 503—525 (1967).

7. BukhaH A. L, Shapiro J. A., Adhya S. L. (ed.). DNA insertion elements, plasmids, and episomes. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1977.

8. Caro L., Berg С. M. Methods Enzymol., 21D, 444—458 (1971).

9. Costoy S. D., Olshi M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 84—87 (1973).

10. Curtiss R, III. J. Bacteriol., 89, 28—40 (1965).

11. Curtiss R., Ill, Annu. Rev. Microbiol., 23, 69—136 (1969).

12. Curtiss R., Ill, Fenwick R. G., Jr., Goldschmidi R., Falkin-gham J. 0„ III. In; S. Mitsuhashi (ed.). R factor drug resistance plasmid, p. 109—134. University of Tokyo Press, Tokyo, 1977.

13. Curtiss R„ III, Macrina F. L„ Falkingham J. О. III. In: R. C. King (ed.), Handbook of genetics, vol. 1, p. 115—133. Plenum Publishing Corp., New York, 1975.

14. Demerec M., Adelberg E. A., Clark A. J., Hart man P. E. Genetics, 54, 61—76 (1966).

15. Enea V., Vovis G. F., Under N. D. J. Mol. Biol., 96, 495—509 (1975).

16. Falkow S. Infections multiple drug resistance. Pion Limited, London, 1975.

17. Goldberg R. В., Bender R. A., Stretcher S. L. J. Bacteriol., 118, 810—814 (1974).

18. Hayes W. The genetics of bacteria and their viruses, 2nd ed. John Wiley and Sons, Inc., New York, 1968

19. Hershey A. D. The bacteriophage lambda. Cold Spring Harbor, New York, 1971.

20. Hong J.-S., Ames B. N. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 68, 3158— 3162 (1971).

21. Jacob F., W oilman E. L Sexuality and the genetics of bacteria. Academic Press, Inc., New York, 1961.

22. Juni E. J. Bacteriol, 112, 917—931 (1972).

23 Juni E., Janik A. J Bacteriol., 98, 281—288 (1969).

24. Lennox E. S. Virology, 1, 190—206 (1955).

25. Lewin B. Gene expression — 3. Plasmids and phages. John Wiley and Sons, Inc., New York (1977).

26. Lodish H. F. J. Mol. Biol., 50, 689—702 (1970).

27. Low К. B. Bacteriol. Rev., 36, 587—607 (1972).

28. Mandel ПЛ., Higa A. J. Mol. Biol., 53, 159—162 (1970).

29. Marmur I. J. Mol. Biol., 3, 208—218 (1961).

30. Nishimura Y, Caro L., Berg С. M., Hirota Y. J. Mol. Biol., 55, 441 — 456 (1971).

31. Notani N. К-, Setlow J. K. Prog. Nucleic Acid Res, 14, 39—100 (1974).

32. Novick R. P., Clowes R. C.t Cohen S. N., Curtiss R.t III, Datta N., Falkow S. Bacteriol. Rev., 40, 168—189 (1976).

33. Ozeki H. Carnegie Inst. Washington Publ. 612, p. 97—106 (1956).

34. Sawula R. V., Crawford I. P. J. Bacteriol., 112, 797—805 (1972).

35. Shimada K., Weisberg R. A., Gottesman M. E. J. Mol. Biol, 63, 483—503 (1972).

36. Tomasz A. Annu. Rev. Genet, 3, 217—232 (1969).

37. Vogel H. J., Bonner D. M. J. Biol. Chem, 218, 97—106 (1956).

38. Willetts N. S. In: S. Mitsuhashi (ed\), R factor drug resistance plas-mid, p. 89—107. University of Tokyo Press, Tokyo (1977).

39. Under N. D., Lederberg J. J. Bacteriol, 64, 679—699 (1952).

Глава 15

ПЛАЗМИДЫ

Дж. Кроса, С. Фалкоу

Термин «плазмиды» впервые был применен Ледер-бергом [21] для обозначения всех внехромосомных наследственных детерминант. В настоящее время под этим термином понимают независимо реплицирующуюся вне-хромосомную ДНК бактерий. Хотя плазмиды не обязательны для жизнедеятельности бактерий в целом, они могут кодировать разнообразные генетические детерминанты, позволяющие бактериям-хозяевам лучше выживать в неблагоприятных условиях или успешнее конкурировать с другими микроорганизмами, занимающими ту же экологическую нишу. Плазмиды имеются у множества бактерий и рассматривать в общем плазмиды так же трудно, как рассматривать в общем несущие их бактерии. В медицинском отношении важны, как известно, плазмиды, определяющие устойчивость к антибиотикам,— R-плазмиды, а также те из них, которые прямо оказывают влияние на патогенность микробов. Однако с позиций изучения структуры и функции ДНК все плазмиды представляют одинаковую ценность. В последнее время плазмиды приобрели первостепенное значение в технике создания рекомбинантных молекул ДНК.

Методы, которыми при помощи плазмид изучают перенос генов, были описаны в гл. 14. Данная же глава посвящена выделению и характеристике плазмид, в основном плазмид грамотрицательных бактерий, так как они изучены лучше других. Тем не менее описываемые методы могут быть с успехом применены к плазмидам любой бактерии, если имеются подходящие способы их выделения из клеток в мягких условиях.

Многие методы, применяемые в настоящее время для выделения плазмидной ДНК, основываются на ее суперспиральной ковалентно замкнутой кольцевой структуре. Согласно всем этим методикам, необходим лизис

клеток в мягких условиях, так чтобы плазмидная ДНК сохранялась при этом в интактном состоянии и могла быть отделена физическими методами от более массивной хромосомной ДНК. Хотя обычно плазмидная ДНК имеет мол. массу в пределах 0,5—100-106, у некоторых больших плазмид она может составлять 100—300 * 106 [2, 12, 22, 24, 26, 27, 30]. Для сравнения напомним, что хромосомная ДНК Е. coli имеет мол. массу 2200—3000-•106.

Выявление свойств бактериальной плазмиды обычно начинают на генетическом уровне. Если есть подозрение на то, что какой-то бактериальный признак обусловлен плазмидой, в экспериментах по переносу генов часто можно показать передачу плазмидных детерминант независимо от хромосомных. Если же этот признак исчезает при обработке бактериальной популяции излечивающими агентами, такими, как акридиновый оранжевый или бромистый этидий, то можно быть почти уверенным в его плазмидном происхождении. В большинстве случаев, однако, необходимо непосредственно убедиться в существовании плазмиды и в том, что именно она определяет изучаемый генетический признак.

Если есть возможность, лучше всего перенести генетическими способами плазмиду какой-либо бактерии-хозяину, о которой известно, что она не имеет собственных плазмид. Для многих грамотрицательных бактерий этой цели лучше всего отвечает один из хорошо изученных F~-uiTaMMOB Е. coli К-12, такой, например, как С600. Хорошо охарактеризованные бесплазмидные штаммы известны и для других видов (например, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Serra-tia marcescens, Shigella flexneri, Salmonella typhi и др.). Бесспорное преимущество такого подхода заключается в том, что после переноса отдельной плазмиды в подобный штамм при ее последующем выделении нет боязни загрязнения плазмидами клетки-хозяина.

В тех случаях, когда генетические методы недоступны, приходится прямо проверять бактерию на содержание плазмид. Обычно таким анализом можно определить лишь, имеется плазмида или нет. Затем можно провести соответствующую проверку штамма, потерявшего генетический признак (спонтанно или в резу

страница 22
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)