лямбда

Для прикрепления и проникновения в бактериальную клетку бактериофага % на поверхности клетки должны присутствовать белки переноса мальтозы, синтез которых тормозится глюкозой по механизму катаболитной репрессии. Поэтому агар лямбда не должен содержать глюкозу. При его приготовлении на 1 л воды добавляют 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCI и 12 г агара. рН доводят до 7,0 перед автоклавированием добавлением 1,7 мл 1 н. NaOH. Мягкий агар лямбда содержит 0,65% агара и 10 мМ Mg2+.

14.4.3. Супер-бульон [26]

Приготовление л-фаголизатов и лизатов многих других фагов лучше всего удается, когда для выращивания клеток-хозяев используют богатую питательную среду. Одна из таких сред — супер-бульон — содержит в 1 л 32 г триптона, 20 г дрожжевого экстракта и 5 г NaCI. рН доводят до 7,0 перед автоклавированием добавлением приблизительно 5 мл 1 н. NaOH. Для лучшего размножения фага к бульону после автоклавирования добавляют MgS04 до 10 мМ. Обычно для работы готовят водный раствор 1 М MgS04.

14.4.4. Агар Penassay

Имеющийся в продаже агар Penassay вполне удовлетворителен в качестве общей комплексной агаровой среды, но добавление NaCI (8 г/л) значительно расширяет область его использования во многих экспериментах по бактериальной генетике. Имеющийся в продаже бульон Penassay уже содержит моновалентные катионы.

14.4.5. ЕМВ-агар и агар Мак-Конки

Изготавливаемые в промышленных масштабах агары ЕМВ и Мак-Конки являются удовлетворительными индикаторными в отношении брожения средами при работе с грамотрицательными кишечными бактериями. Однако, поскольку многие штаммы Е. coll, Salmonella, а также другие штаммы, используемые в экспериментах по переносу генов, имеют мутации, которые делают их ауксо-трофами по отношению к пуринам, пиримидинам и (или) витаминам, следует на каждый литр среды добавлять 5 г дрожжевого экстракта. Желательно также добавление NaCl в количестве 5 г/л в среды, используемые для проверки чувствительности штаммов бактерий к фагу. Агары ЕМВ и Мак-Конки обычно дополняются сахара-ми до конечной концентрации 1% и обозначаются EMB-hGal, Mac + Lac и т. д. ЕМВ-агар, не содержащий Сахаров, используется для проверки чувствительности бактерий к фагам и обозначается как ЕМВО-агар. В табл. 14.3 перечислены концентрации стерильных исходных растворов наиболее часто используемых Сахаров.

14.4.6. Минимальная среда VB-E [37]

Для приготовления 50-кратного исходного раствора в 670 мл дистиллированной или деионизованной воды последовательно растворяют 10 г MgS04-7H20, 100 г лимонной кислоты, содержащей один остаток воды, 500 г безводного К2НРО4 и 175 г NaNH4P04-4Н20. Окончательный объем раствора 1 л. Чтобы приготовить однократную жидкую минимальную среду VB-E, приливают 20 мл стерильного 50-кратного раствора к приблизительно 960 мл стерильной дистиллированной или деионизованной воды с таким расчетом, чтобы при внесении стерильного раствора углеводов и других требуемых добавок (см. ниже) конечный объем равнялся бы I л. Для приготовления однократной минимальной агаровой среды VB-E к 960 мл дистиллированной или деионизованной воды добавляют 15 г агара и автоклавируют; после остывания до 60—70 °С добавляют 20 мл стерильного 50-кратного раствора и соответствующее количество углеводных и других добавок. При использовании в качестве индикатора брожения триметилтетразолий-хлорида его добавляют к агару перед автоклавировани-ем. Однократные минимальные жидкая (ML) и агаровая (МА) среды имеют рН 7.

14.4.7. Солевой буфер с желатиной (СБЖ; [10])

СБЖ относится к растворам, используемым для разведения. Присутствующая в нем желатина стабилизирует фаговые частицы и хрупкие бактериальные клетки, а также улучшает точность разведений. Для приготовления СБЖ смешивают 8,5 г NaCl, 0,3 г безводного КН2Р04, 0,6 г безводного Na2HP04, 10 мл 1%-ной желатины и 990 мл воды.

14.4.8. Добавки

Углеводные источники энергии для бактерий (табл. 14.3) обычно добавляют к минимальным средам до конечной концентрации 0,5%.

Таблица 14.3. Концентрации стерильных исходных растворов

источников углерода"

Источники углерода Концентрация основного раствора, % Источники углерода Концентрация основного раствора, %

L-Арабиноза 20 Мальтоза 30

D-Галактоза 30 D-Маннитол 10

D-Глюкоза 40 Янтарнокислый нат- 20

D-Глицерин6 40 рий

Лактоза 20 D-Ксилоза 30

Все концентрации приведены в единицах веса на объем Подогрев дистиллированной (или деионизованной) воды способствует растворению углеводов, но перед доведением до точного объема этим растворам дают остыть до комнатной температуры. Перед использованием все растворы стерилизуют автоклавированием (для объемов, не превышающих 250 мл в течение 20 мин) и затем хранят при 4 °С.

^ Поскольку глицернн — жидкость, для получения ело 40%-пого (вес/объем) раствора добавляют 31,7 мл исходного раствора к 68,3 мл воды.

Казаминовые кислоты или другие кислотные гидро-лизаты казеина, как правило, добавляют к минимальным средам до конечной концентрации 0,5%. 10%-ные (вес/объем) исходные стерильные растворы хранят при 4°С. Добавка аминокислот к минимальным средам стимулирует рост бактерий и особенно полезна при проведении генетических экспериментов с мутантами, требующими присутствия триптофана (который разрушается при кислотном гидролизе белков), пуринов, пиримиди-нов и витаминов. В последнем случае используют смесь аминокислот без примесц витаминов.

Оптимальные концентрации добавляемых в минимальные среды аминокислот, пуринов, пиримидинов и витаминов, при которых становится возможным рост клеток с ауксотрофными мутациями, часто приходится определять эмпирически. Среди факторов, имеющих важное значение при подборе концентраций добавляемых веществ, укажем следующие: количество добавляемого соединения в биомассе клеток, эффективность проникновения этого соединения в клетку, использование его для синтеза клеточных компонентов, способность бактерий расщеплять добавляемое вещество. В табл. 14.4 приведены концентрации аминокислот, пуринов, пиримидинов и витаминов в стерильных исходных концентрированных растворах и конечные концентрации этих веществ при добавлении к минимальным средам, позволяющие обеспечить максимальный рост мутантных штаммов Е. coli и других грамотрицательных бактерий.

В экспериментах, связанных с переносом генов, часто используются штаммы бактерий, обладающие устойчивостью к антибиотикам либо за счет хромосомных мутаций, либо за счет присутствия R-плазмид (гл. 15). В табл. 14.5 включены концентрации антибиотиков в исходных концентрированных растворах и концентрации антибиотиков, обычно используемые в опытах по переносу генов, в средах для грамотрицательных кишечных бактерий. Следует отметить, что в стерилизации исходных концентрированных растворов антибиотиков нет необходимости, если были соблюдены соответствующие меры предосторожности во время их приготовления. При этом используют бумагу для взвешивания из закрытой коробки или запечатанного контейнера (бумага, нахоПродолжение табл. 14.4

Соединения Концентрация основного раствора, мг/мл Количество основного раствора, добавляемого иа 1 л минимальной среды, мл Конечная концентрация в минимальных средах, мкг/мл

Витамины

Биотин 0,25 2,0 0,5

Никотиновая кислота 0,5 2,0 1

Пантотенат кальция 0,5 2,0 1

Пиридоксин-НС1 0,5 2,0 1

Тиамин-НС1 0,5 2,0 1

Все основные концентрированные растворы готовят на дистиллированной или Деионизованной воде и хранят при 4 °С, если нет других указаний. Стерилизовать можно либо автоклавированием (15 мин для объемов, не превышающих 100 мл), либо фильтрованием.

^ Приведенные концентрации обеспечивают оптимальный рост ауксотрофов Е, coli. Для мутаитиых штаммов других видов бактерий могут понадобиться несколько отличные концентрации.

8 L-Изомеры рекомендуются в том случае, если их цена не более чем вдвое превышает цену DL-рацемата,

г Бактерии, обладающие аланинрацемазой, способны утилизировать кал так и L-изомеры.

^ Раствор L-цистениа-HC1 должен быть свежеприготовленным (ие более недельной Давности), так как цистеин быстро окисляется до цистина, который очень плохо растворяется. Другой способ предохранения основного раствора L-цистеина-НС1 от окисления — после автоклавирования наслоить на него стерильное вазелиновое масло.

е Готовят в 0,001 н. NaOH и хранят при комнатной температуре. ж Готовят в 0,01 н. NaOH и хранят при комнатной температуре.

3 Готовят в 0,03 н. HC1.

а thyA-Мутантам энтеробактерий требуются относительно большие концентрации тимииа или тимидина. Штаммы thyA с мутациями \deoB или deoC (при которых блокируются функции дезоксирибомутазы и дезокснрибоальдола-зы соответственно) не способны утилизировать дезоксирибозо-1-фосфат и поэтому растут при пониженных концентрациях либо тимииа, либо тимидина.

дящаяся в упаковке, как правило, стерильна), стерильные емкости (бутыли или пробирки) и стерильную воду или спирт для приготовления суспензий. Заметим, что ампициллин, рифампин и тетрациклин относительно нестойки; в связи с этим среды, содержащие эти антибиотики, должны быть израсходованы в течение нескольких дней. Срок хранения сред с тетрациклином и рифампиТаблица 14.5.

Концентрации антибиотиков для основных растворов и добавок к средам

Конечная концентрация в среде (мкг/мл) для выявления

Антибиотик

Концентрация основного раствора, мг/мл

устойчивости, обусловленной R-плазми-дами

устойчивости, обусловленной хромосомной мутацией

Ампициллин

Хлорамфеникол

Налидиксовая кислота

Рифампин

Стрептомицин

Тетрациклин

а

25б 10е

50е

ж

25—50 25—50

25—50 25—50

10—20

50г 50

100—400

Растворы ампициллина нестабильны, поэтому взвешенный порошок антибиотика суспендируют в стерильной воде и сразу добавляют к средам до желаемых конечных концентраций Можно также приготовить исходный кон центрированный раствор и хранить его при —20 °С, Чтобы получить точную концентрацию чистого ампициллина, следует ввести поправки на буферы и другие ингредиенты.

^ Суспендируют в 50%-ном этаноле и хранят при 4 °С

Суспендируют в 0,1 н. NaOH, превращающем кислоту в