Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

шенной функцией (определяемой обычно белком). Такие штаммы имеют тенденцию спонтанно ревертировать к родительскому типу, проявляя таким образом генетическую нестабильность и частичную физиологическую неполноценность. Значительная часть мутаций с заменой оснований представляет собой нонсенс-мутации (бессмысленные мутации), характеризующиеся тем, что кодирующий какую-либо аминокислоту триплет превращается в триплет, не кодирующий никакой аминокислоты. В этом случае синтез соответствующего белка прерывается на измененном триплете, а образующийся незавершенный фрагмент белковой молекулы, как правило, не способен выполнять предназначенной исходному белку функции. Поэтому нонсенс-мутации фенотипи-чески выражены, а способность ревертировать у них сохраняется. Мутации со сдвигом рамки возникают в случае вставки или делеции одного или нескольких оснований в молекулу ДНК- При этом происходит сдвиг рамки при считывании закодированной информации и как следствие — изменение последовательности аминокислот в белке мутантного штамма.

Если нужно получить мутант, генетический дефект которого нельзя компенсировать добавками питательных веществ (например, дефекты ферментов, участвующих в репликации ДНК и РНК, дефекты в каком-либо элементе белоксинтезирующего аппарата), его следует искать среди условно летальных мутантов, которые жизнеспособны лишь при определенных условиях. Примерами таких мутантов могут служить температурочувстви-тельные мутанты и штаммы, несущие супрессорные нонсенс-мутации. В табл. 13.1 приведены свойства мутаций различных типов; она может служить ключом для выбора наиболее подходящего типа мутанта в соответствии с определенной целью.

13.2. ВЫБОР МУТАГЕНА

Независимо от конкретных условий применения мутагена его выбор определяется прежде всего двумя факторами: тем типом мутации, которую хотят получить (т. е. замена оснований, делеция или сдвиг рамки), и относительной эффективностью мутагена в отношении желаемой мутации. Для определенной цели могут подойти не одна, а несколько мутаций, в то же время нужную мутацию могут эффективно вызывать не один, а несколько мутагенов.

Многочисленные исследования по мутагенной специфичности различных типов излучений, а также химических и физических агентов показали, что, хотя многие мутагены вызывают изменения в ДНК лишь одного преобладающего типа, большинство мутагенов, помимо основного изменения, может вызывать изменения и других типов — с частотами от низкой до умеренной. Например, такие мутагены, как этилметансульфонат (ЭМС), нитро-зогуанидин (НТГ), гидроксиламин и азотистая кислота, вызывают в основном простую замену пары GC на AT в двухцепочечной ДНК [Ю, 22, 23]. Однако все они вызывают незначительное число транзиций AT—>-GC, а также некоторые трансверсии. Транзиция — это замена в ДНК какого-либо одного пурина (аденина или гуанина) или пиримидина (тимина или цитозина) на другой пурин или пиримидин соответственно. Трансверсия — это такая мутация, при которой происходит замена пурино-вого основания на одно из двух пиримидиновых или наоборот.

Аналоги оснований, такие, как 2-аминопурин и 5-бромурацил, преимущественно вызывают транзиций типа AT—>~GC, но с гораздо меньшей частотой могут приводить к транзициям GC—>-АТ. Такое отсутствие полной мутагенной специфичности обусловлено, вероятно, не только механизмом действия мутагена, но и локальным окружением мутирующего основания (влияние соседнего основания или вторичной структуры ДНК). (Эти представления обсуждаются в работе [23].) В связи с этим при оценке типа мутаций, вызываемых даже очень специфичными мутагенами, необходимо быть очень осторожными; для подтверждения выявленного типа следует провести соответствующий анализ мутантов. Тем не менее можно считать, что большинство мутантов из числа индуцированных данным мутагеном будут принадлежать к одному типу, определяемому основной специфичностью мутагена. В табл. 13.2 приведены свойства некоторых наиболее часто используемых в бактериальной генетике мутагенов.

Мутагены не только увеличивают частоту мутаций: многие из них представляют собой сильнодействующие канцерогены — вещества, способные вызывать опухоли у млекопитающих [19]. Эймс и др. [7,8] разработали бактериальную тест-систему для эффективного выявления корреляции этих двух свойств и показали, что многие канцерогены обладают также и мутагенной активностью. Подробности их метода будут в дальнейшем рассмотрены в настоящей главе (разд. 13.8.2).

Предупреждение. При работе с мутагенами особое внимание следует обратить на непосредственное обращение с ними и ликвидацию остатков. Растворы мутагенов ни в коем случае нельзя насасывать через пипетку ртом. При взвешивании и других количественных измерениях этих веществ необходимо надевать сменные перчатки. Чтобы избежать попадания мутагенов в организм с вдыхаемым воздухом, все манипуляции с их порошкообразными и летучими формами следует проводить под тягой. Растворы мутагенов нельзя сливать в раковину; лучше пропитать ими соответствующие твердые материалы (такие, как вермикулит) и поместить в герметичный контейнер, подобно другим опасным отходам. Если мутагены непосредственно используются в эксперименте в составе твердых или жидких питательных сред, термостаты, в которых инкубируются чашки или колбы, должны иметь искусственную вытяжку или не должны сообщаться с лабораторной атмосферой.

13.2.1. Ультрафиолетовый свет

Облучение ультрафиолетом представляет собой один из простейших и самых удобных способов получения разнообразных бактериальных мутантов. Для этого пригодны практически любые источники ультрафиолетового света с испусканием в коротковолновой области (около 253,7 нм). Следует лишь один раз откалибровать источник для получения оптимальной дозы облучения.

Методика

1. Выращивают родительский бактериальный штамм в 50 мл L-бульона (разд. 13.9.1) или питательного бульона (разд. 13.9.11) при 37 °С до плотности, близкой к 2-108 клеток в 1 мл.

2. Культуру охлаждают во льду в течение нескольких минут для предотвращения дальнейшего роста, делят на порции по 5 мл и центрифугируют для осаждения клеток при 5000—6000 g 5 мин.

3. Ресуспендируют осадок каждой порции в 2,5 мл стерильного раствора ОД М MgS04 в дистиллированной воде. Необлученную суспензию, которая служит контролем, в разведении 10~б—10~~7 наносят на L-arap (разд. 13.9.2).

4. В течение 15—20 мин прогревают ультрафиолетовую лампу (253,7 нм). Неразведенные суспензии переносят в стерильные стеклянные чашки Петри диаметром 100 мм, которые ставят под лампой (без крышек). Покачиванием чашек обеспечивают равномерное облучение суспензии. Время облучения от чашки к чашке рекомендуется последовательно увеличивать в 10 раз (например, от 15 с до 2,5 мин). Тем самым будет обеспечен диапазон летальности клеток.

5. Немедленно делают несколько десятикратных разведений каждой из суспензий; при слабом освещении разведенные суспензии высевают на L-arap (разд. 13.9.2) или питательный агар (разд. 13.9.12) для определения титра жизнеспособных клеток.

6. Остаток каждой из неразведенных облученных суспензий центрифугируют и осадок клеток ресуспендируют в 10 мл L-бульона (разд. 13.9.1).

7. Инкубируют клетки в течение ночи при 37 °С в пробирках или колбах, обернутых алюминиевой фольгой, либо в темной комнате во избежание фотореактивации. Чтобы впоследствии получить ряд независимых му-тантных штаммов, следует перед инкубацией разлить каждую облученную суспензию по нескольким пробиркам (разд. 13.3).

Возможные трудности

Относительное число клеток, погибших при облучении ультрафиолетом, сильно зависит от источника облучения и условий эксперимента. Для стандартизации условий облучения следует построить кривую выживания. В слишком концентрированных бактериальных суспензиях (5-Ю8 клетка/мл) при облучении имеет место эффект экранирования, обусловливающий неодинаковый процент гибели клеток. Оптимальные результаты дает доза в среднем около 500 эрг/мм2, и, если есть возможность воспользоваться дозиметром, нужно ориентироваться на эту цифру. Поскольку ультрафиолет — относительно слабый мутагенный фактор, наилучшие результаты получают при норме выживания от 0,1 до 1%. Наконец, следует по возможности уменьшить эффект фотореактивации. Этого добиваются точным соблюдением условий получения ультрафиолета (без примеси видимого света) и последующим выращиванием бактерий в полной темноте.

13.2.2. Нитрозогуанидин

Соединение с метильной группой 1Ч-метил-1Ч'-нитро-N-нитрозогуанидин (НТГ)—один из самых мощных известных в настоящее время мутагенов бактерий. Он вызывает главным образом транзиций типа GC—>-АТ, значительно реже — транзиций типа AT—»-GC, трансверсии и даже мутации со сдвигом рамки.

Методика

1. Выращивают клетки подходящего бактериального штамма до середины логарифмической фазы (концентрация 5-Ю8 клетка/мл) в 10 мл L-бульона (разд. 13.9.1) или питательного бульона (разд. 13.9.11).

2. Культуру центрифугируют в течение 5 мин при 5000 g и осадок ресуспендируют в равном объеме трис-малеинового буфера (разд. 13.9.4), рН 6,0.

3. Добавляют к суспензии свежеприготовленный раствор НТГ (1 мг в 1 мл стерильной воды) до конечной концентрации 100 мкг/мл. Инкубируют 30 мин при 37 °С без встряхивания.

Азотистая кислота

НТГ

эмс

Соединения группы ICR

Акридиновые красители, бромистый этндий

Новобиоцин

Дезаминирование ци-тозина и аденина

Алкилироваиие оснований в репликатив-ной вилке

Алкилироваиие гуанина

Интеркаляция между основаниями вовремя репликации

То же

Блокирование репликации ДНК

Транзиций в обоих направлениях, деле-ции

Преимущественно транзиций типа GC-^AT

Преимущественно транзиций GC-+-AT, отчасти траизиции AT->GC и траисвер-сни

Сдвиг рамки за счет вставки и делеции оснований

Сдвнг рамки, потеря внехромосомных элементов

клеток

Излечивание от плазмид

Средняя

Очень высокая

Средняя

Высокая

Низкая

Высокая

Высокая мутагенность при низком уровне летальности, вызывает множественные мутации на ограниченном участке

Мутагенные эффекты, сходные с эффектами НТГ, но меньшая

страница 2
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)