Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

азу и, следовательно, невозможность использования лактозы в качестве источника углерода. Реципиент (штамм 8, табл. 14.1) должен обладать генотипом tacZ+proC, чтобы при отборе трансдуктантов по ргоС* некоторые из них могли иметь наследуемую мутацию донора lacZ, трансдуцирующуюся совместно с мутацией ргоС+. Эти два гена котрансдуцируются примерно в 30% случаев. Для описанного эксперимента подходит фаг PI kc независимо от того, способен он лизогенизи-ровать реципиентный штамм или нет.

Среды

Для выращивания бактерий, приготовления лизата и определения фага Р1 используют L-бульон, L-arap (1,2% агара) и мягкий L-arap (0,65% агара), содержащий 2,5 мМ СаСЬ; для бактериальных проб — агар Penassay и для отбора трансдуктантов — среду VB-E, дополненную 1% лактозы, 0,4% двузамещенного янтар-нокислого натрия и 50 мкг/мл трифенилтетразолийхло-рида. На последней среде трансдуктанты 1ас+ргоС+ имеют белые колонии, а трансдуктанты lacZproC+ способны расти благодаря наличию сукцината как источника углерода, образуя колонии красного цвета. Цитрат-ион, находящийся в среде VB-E, связывает Са2+, требуемый для адсорбции фага Р1, и поэтому заражение этим фагом бактерий на селективной среде сводится к минимуму. Методы приготовления сред см. в разд. 14.4.

Определение титра фага

1. Добавляют 1 мл 12-час культуры (выращенной в L-бульоне в отсутствие СаСЬ без принудительной аэрации; см. 1-й этап в «Осуществлении трансформации» в разд. 14.1.4) Р1-чувствительного штамма донора к 9 мл L-бульона, содержащего 2,5 мМ СаСЬ.

2. Далее аэрацию культуры обеспечивают посредством пропускания пузырьков воздуха или встряхиванием при 37 °С в течение 60—90 мин до тех пор, пока культура не достигнет титра, приблизительно равного 2-108 клетка/мл.

3. Пока культура растет, делают разведения (Ю-5, 10~6 и 10~7) L-бульоном, содержащим 2,5 мМ СаСЬ, фаголизата PI L4 (или PI kc)y титр которого должен быть равен 1010 ПОЕ/мл.

4. Аликвоты выращенной культуры Р1-чувствительного штамма объемом 1,9 мл разливают по пробиркам диаметром 13 и высотой 100 мм при 37°С.

5. После нескольких минут, требуемых для уравнения температуры, добавляют из каждого разведения фаголизата Р1 100 мкл и оставляют на 20—30 мин, чтобы произошла адсорбция фага на бактериальных клетках.

6. Вносят по 200 мкл полученной смеси в 2 мл мягкого L-arapa и немедленно выливают на поверхность L-arapa, содержащего 2,5 мМ СаС12. Через 5 мин чашки переворачивают и инкубируют при 37 °С.

Стерильные пятна становятся видимыми через 6 ч инкубации; их диаметр варьирует в пределах 0,5—1 мм. Чашки с пробами на PI L4 можно инкубировать перед подсчетом в течение ночи, а на PI kc— порядка 6 ч, так как в случае инкубации, продолжающейся всю ночь, из-за роста лизогенизированных клеток в центре чашки пятна становятся мутными и трудно различимыми. Титр фага равен числу пятен, умноженному на 100 и на величину, обратную соответствующему разведению.

Приготовление лизата трансдуцирующего фага

1. Выращивают нужный штамм бактериального донора, как это описано выше в «Определении титра фага» (этапы 1 и 2).

2. Фаголизат PI L4 (или PI kc) разводят в L-бульоне с 2,5 мМ СаСЬ так, чтобы в 1 мл содержалось 6-Ю7 — 8-107 ПОЕ, и добавляют по 100 мкл лизата к 1,9 мл культуры донора, находящейся в логарифмической фазе (в пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм) при 37 °С.

3. Оставляют пробы на 20—30 мин для предварительной адсорбции фага Р1.

4. Из каждой пробы отбирают 200 мкл смеси, добавляют к 2 мл мягкого L-arapa +2,5 мМ СаС12 и немедленно разливают по поверхности L-arapa+ 2,5 мМ СаС12 в чашке. Таким способом готовят от пяти до восьми чашек. (На каждую чашку следует засевать от 6-Ю5 до 8-Ю5 клеток донора, зараженных фагом PI L4 или Р1 kc, при избытке незараженных бактерий.) Через 5 мин чашки переворачивают и инкубируют 6 ч при 37 °С.

5. Наливают на поверхность агара в каждую чашку 3—5 мл L-бульона, содержащего 10 мМ MgS04 (но не СаС12). С помощью стеклянного шпателя размельчают слой мягкого агара и собирают его в центрифужный стакан объемом 40—50 мл из полипропилена (или другого материала, устойчивого к СНСЬ). Добавляют примерно 100 мкл СНСЬ на каждые 4 мл лизата, плотно закрывают центрифужный стакан и интенсивно перемешивают содержимое в течение 1—2 мин на миксере типа Vortex. Стакан оставляют на 2 ч при комнатной температуре или на ночь в холодильнике, чтобы фаг Р1 успел про-диффундировать в водную фазу. Время от времени перемешивание можно повторять.

6. Неочищенный лизат центрифугируют при 5000— 6000 g в течение 10—15 мин и осторожно декантируют надосадочную жидкость в колбу или пробирку с завинчивающейся крышкой. Добавляют к полученному лиза-ту несколько капель СНСЬ и энергично встряхивают. Хранят лизат при 4°С.

На следующий день определяют титр лизата, как это было описано ранее, и проверяют его стерильность посевом небольшого количества в чашку с L-агаром или агаром Penassay. Такие лизаты относительно стабильны, но за год при температуре хранения 4°С их титр может упасть на 1—2 порядка. Полной стабильности фаголизата Р1 достигают фракционированием в градиенте CsCl с последующим удалением CsCl диализом против L-бульона+Ю мМ MgSCU [8].

Создание бактерий, лизогенных по фагу Pike

Когда эксперименты по трансдукции проводят с целью количественной оценки частоты генов в клетках-донорах, котранедукции и др., целесообразно использовать реципиентные штаммы, лизогенные по фагу PI kc. В тех же случаях, когда трансдукцию применяют для создания штаммов, это нежелательно. Лизогенные реципиентные штаммы создают следующим образом.

1. Выращивают нужный реципиентный штамм, как описано выше в «Определении титра фага» (этапы 1 и 2).

2. Вносят по 0,9 мл культуры в пробирки размером 13X100 мм и оставляют при 30°С на 5 мин для уравнивания температуры.

3. Добавляют 0,1 мл фаголизата PI kc с таким расчетом, чтобы на одну бактерию приходилось 3 ПОЕ. Если лизат не разводился по крайней мере в 10 раз, нужно быть уверенным в отсутствии следов СНСЬ, что необходимо для предотвращения гибели клеток реципиента,

4. Инкубируют при 30 °С 2—3 ч. При инфекции фагом Р1 лизогенизации благоприятствует пониженная температура (20—30 °С), а литической реакции — высокая температура (37—42°С).

5. Для получения отдельных колоний делают посев культуры штрихом в чашку с агаром Penassay или L-агаром или обычный посев соответствующего разведения.

6. Отбирают и очищают 10 хорошо обособленных колоний (нерастекающихся и с правильными гладкими краями )на L-arape, применяя общие методы, описанные в 10-м этапе «Осуществления трансформации» в разд. 14.1.3.

7. Отбирают хорошо обособленную колонию каждого из 10 изолятов в пробирку диаметром 13 и высотой 100 мм, содержащую 2 мл L-бульона-+1мМ цитрат (без СаС12). Пронумерованные 10 культур инкубируют при 42 °С 4—6 ч до получения концентрации примерно 2• 108 клетка/мл. При 42°С увеличивается скорость спонтанной индукции бактерий, лизогенных по фагу PI, а благодаря отсутствию ионов Са2+ фаг Р1, высвобождаемый вследствие спонтанной индукции, накапливается.

8. Проверяют, действительно ли предполагаемые бактерии, лизогенные по фагу Р1, высвободили его во время роста при 42 °С.

а) Вносят по I мл каждой из десяти культур и 1 мл культуры

исходного Р1-чувствительного штамма (в качестве контроля) в пронумерованные пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм при 42 °С.

б) В каждую пробирку добавляют каплю СНС13, встряхивают

н продолжают инкубировать в течение 15—20 мнн.

в) Делают последовательные десятикратные разведеиня фаголизата Pi kc от 10-1 до Ю-8.

г) Добавляют 200 мкл культуры Р1-чувствительного штамма,

выращенного в Ь-булоне+2,5 мМ СаСЬ и находящегося в логарифмической фазе, к 2 мл расплавленного мягкого L-arapa + 2,5 мМ

СаС12. Выливают агар в чашку с агаром ЕМВО+2,5 мМ СаС12 и

дают слою мягкого агара затвердеть.

д) Наносят максимально наполненной петлей на поверхность

мягкого агара одной чашки с ЕМВО пробы нз одиннадцати обработанных хлороформом культур и восьми последовательных разведений фага Р1. Чтобы высвободить все содержимое, взятое петлей, ее

краем прикасаются к поверхности агара. Крышку чашки Петри

оставляют приоткрытой до тех пор, пока нанесенный материал не

впитается в мягкий агар. На дне чашки отмечают положение всех

нанесенных проб.

е) Лучше всего инкубировать чашку с ЕМВО неперевернутой

при 37 нли 42 °С в течение ночи.

Области лизиса (сплошного или в виде пятен) должны наблюдаться для каждого обработанного хлороформом экстракта, приготовленного из клеток, лизо-генных по фагу Р1, означая тем самым, что во время роста при 32 °С высвободилось достаточное количество фага Р1. Нанесения разведений лизата Р1 дают представление о чувствительности метода.

9. Проверяют, устойчивы ли к фагу Р1 клетки, лизогенные по этому фагу.

а) Наносят 50—100 мкл фаголизата P1L4 (содержащего

~1010 ПОЕ/мл) ниже центра чашки с агаром ЕМВО + 2,5 мМ СаС12.

Оставляют крышку приоткрытой, пока нанесенная полоса не подсохнет. Размечают на дне чашки направление и расположение всех

полос.

б) Набирая каждый раз по полной петле, делают посев в виде

полос, пересекающих полосу лизата всех десяти культур, как предполагают лизогенных по фагу Pi, и культуры жизнеспособного

Р1-чувствительного исходного штамма.

в) Дают полосам подсохнуть. Переворачивают чашкн и инкубируют их при 37 °С в течение ночи.

Выделенные бактерии, устойчивые к фагу PI L4 и высвобождающие фаг PI kc во время роста при 42°С, можно использовать как источник клеток, лизогенных по фагу Pi kc. Клетки, лизогенные по фагу Р1, проявляют нестабильность, по-видимому, из-за того что профаг Р1 существует в клетке в виде плазмиды, которая иногда теряется. Поэтому после ряда пересевов культур, лизогенных по фагу Р1, может понадобиться их повторное выделение, для которого используют процедуры и проверки, перечисленные выше. Рост лизогенных бактерий в присутствии 2,5 мМ СаСЬ при 37 °С также приводит к спонтанному высвобождению фага Р1, инфицирующего нелизогенную часть культуры, клетки которой либо ли-зируются, либо повто

страница 16
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)