Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

дений лизата: Ю-4, 10 5, Ю-6, Ю-7. После 10—15-мин преадсорбции отбирают из каждой пробирки по 200 мкл и смешивают с 2 мл расплавленного мягкого лямбда-агара, имеющего температуру 45 °С. Немедленно выливают получившуюся смесь на поверхность лямбда-агара в чашке, как описано выше.

8. После того как мягкий агар затвердеет, чашки переворачивают и инкубируют при 37 °С.

Целесообразно дублировать посев каждого разведения на тот случай, если в одной из чашек произойдет размазывание из-за избытка влаги. Надежнее всего титр определяют по результатам учета в чашках, где имеется не менее 50, но не более 400 стерильных пятен. Титр равен среднему числу пятен на чашке, умноженному на 100 и на величину, обратную тому разведению, по которому производили подсчет пятен. В случае определения титра лизата трансдуцирующего фага целесообразно отбирать и высевать некоторое количество лизата на чашку с агаром ЕМВ + Gal, чтобы убедиться в отсутствии жизнеспособных клеток донора.

Описание метода специфической трансдукции

1. Выращивают реципиентный штамм с мутацией по гену gal в 10 мл супер-бульона при 37°С с аэрацией посредством пропускания пузырьков воздуха или встряхивания до титра 2• 108—4• 10s клетка/мл.

2. Осаждают, промывают и суспендируют клетки в 10 мл 10 мМ MgCl2; аэрируемые клетки оставляют голодать при 37 °С в течение 60 мин перед инфицированием,

3. Вносят аликвоты этой культуры (0,9 мл) в стерильные пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм и инкубируют при 30 °С.

4. Делают такие разведения лизата трансдуцирующего фага в 10 мМ MgCh, чтобы добавление 100 мкл к 0,9 мл бактериальной суспензии приводило к численным соотношениям, равным 0,1, 1,0 и 3,0 фага на одну бактерию. Остатки СНС13 удаляют из лизата пропусканием через него потока воздуха

5. Добавляют полученные разведения к пробам реци-пиентных клеток объемом 0,9 мл; одну такую пробу оставляют как контроль неинфицированной, чтобы убедиться в стабильности мутации по гену gal реципиента и в том, что число Са1+-трансдуктантов превосходит число Оа1+-ревертантов, обязательно появляющихся в тех или иных количествах.

6. После 10—15-мин предварительной адсорбции отбирают из каждой пробы 100 мкл и наносят на поверхность агара MA + Gal в каждую из четырех чашек. Для каждого варианта инфекции две чашки инкубируют при 30 °С, а две другие —при 37 °С.

7. Инкубируют чашки двое суток и затем подсчитывают число колоний с фенотипом Gal+

Характеристика свойств трансдуктантов

Для того чтобы охарактеризовать трансдуктанты, их следует отобрать и очистить, как это было описано выше. Обычно для этого используют агаровые среды MA + Gal, EMB-fGal среду Мак-Конки + Gal. Чашки инкубируют при 30 °С В качестве последнего этапа отбирают отдельные колонии каждого трансдуктанта в 2 мл супер-бульона и выращивают культуру при 30°С до концентрации 1-Ю8—2-10s клетка/мл. Клоны Gal+, если их образование вызвано трансдукцией, должны обладать несколькими свойствами, выявление которых проводится следующим образом.

1. Трансдуктанты должны быть лизогенны по отношению к дефектным и недефектным производным фага X cl857, и поэтому они не должны расти при 37 или 42 °С. Чтобы проверить это, из каждой культуры отбирают петлей пробу, наносят ее на агар EMB + Gal в чашке и инкубируют при 37 или 42 °С. В качестве контроля инкубируют пробу при 30 °С.

2. Трансдуктанты должны быть невосприимчивы к фагу X. Это определяют перекрещивающимся посевом. Около 50 мкл лизата фага X с1857 равномерно полосой наносят ниже центра в чашку с агаром EMB0. Через 5—10 мин, когда лизат впитается в агар, наносят полосой взятую петлей чистую культуру трансдуктанта Gal+ таким образом, чтобы она пересекала фаговую полосу. Контролями для этого теста служат штаммы донора и реципиента. Чашки инкубируют при 30°С, Рост неин-фицированных контрольных бактерий в стороне от фаговой полосы определяют по окраске от белой до розовой в чашках с агаром EMB0. Чувствительность к фагу X выявляют по ярко-красному окрашиванию выживших бактерий в месте пересечения фаговой полосы с полосой чувствительного к фагу штамма. Изменение цвета обусловлено продукцией или освобождением кислоты вследствие лизиса части бактерий. Таким образом, агар EMB0 — очень тонко реагирующий индикатор на чувствительность бактерий к умеренным фагам, которые не лизируют все инфицированные клетки.

3. Трансдуктанты должны быть частично диплоидны и гетерозиготны, поскольку они имеют как gal+-t так и

?а/--гены. Это определяют следующим способом. Разводят культуру таким образом, чтобы при распределении 100 мкл по поверхности агара EMB + Gal в чашке после инкубации при 30 °С вырастало 100—300 колоний. Если трансдуктанты частично диплоидны и гетерозиготны, то приблизительно 1—3% колоний выглядят как отрицательные по сбраживанию и имеют окраску от белой до розовой, а остальные положительные по сбраживанию колонии окрашены в темно-фиолетовый или черный цвет. Возникновение фенотипов Gal~ происходит вследствие рекомбинации, приводящей к гомозиготности по признаку gal, исходно имеющемуся у реципиента.

4. Большинство трансдуктантов Galh, возникших при низкой множественности заражения, будут нести лишь геном X^«/-трансдуцирующего фага; некоторые из них можно проанализировать, проинкубировав культуру при 37 °С, с тем чтобы выяснить, высвобождаются ли при этом инфекционные частицы фага X. Это делают следующим образом: 1) разводят культуру выделенных трансдуктантов 1 : 10 в 1—2 мл супер-бульона в пробирках диаметром 13 и высотой 100 мм; 2) инкубируют пробирки при 37°С в течение 2 ч; 3) добавляют каплю СНСЬ, чтобы убить выжившие бактерии; 4) наносят отобранный петлей лизат в чашки с агаром EMB0 или лямбда-агаром и сверху наслаивают 2 мл мягкого лямбда-агара, к которому предварительно добавляют 100— 200 мкл культуры, находящейся в логарифмической фазе роста бактерии, чувствительной к фагу X, и 5) чашки инкубируют в течение ночи при 37 °С. Скорее всего исследуемые Са1+-трансдуктанты будут содержать частицы фага X с геномом dgal и окажутся не способными образовывать фаговые частицы, лизирующие индикаторный штамм, чувствительный к фагу X. Это вызвано тем, что гены фага X, необходимые для литической реакции, заменены генами gal+.

5. Большинство Са1+-трансдуктантов, образующихся при множественном заражении, являются двойными бак-териями-лизогенами, содержащими как профаг дикого типа X с1857, так и профаг с геномом dgal. Инкубация культур этих трансдуктантов при 37°С приводит к спонтанному лизису с высвобождением смеси приблизительно равного количества частиц фага X с1857, которые способны образовывать стерильные пятна, и фага X dgai Способность к образованию пятен в этих лиза-тах проверяют методом, описанным выше. Такие лизаты имеют высокую концентрацию частиц X gal и могут трансдуцировать с образованием типа Gal+ 10—50% реципиентов с мутацией по гену gat. В этом можно убедиться повторной трансдукцией, проводя ее так, как описано выше (разд. 14.2.1), с той лишь разницей, что инфекционную смесь разводят (Ю-3—Ю-5) перед посевом в чашки с агаром MA + Gal. Полученные лизаты были названы трансдуцирующими с высокой частотой (HFT) в противоположность лизатам, трансдуцирую-щим с низкой частотой (LFT), которые образуются при первоначальной индукции при 37°С донорного штамма лизогенной бактерии, содержащей профаг X с1857.

Применение

Специфическая трансдукция облегчает генетические исследования у бактерий, касающиеся, в частности, расположения и регуляции генов. Для Е. coli существует множество фагов, подобно фагу X включающихся в хромосому бактерии в разных местах и позволяющих осуществлять специфическую трансдукцию хромосомных маркеров. Очень важно при этом, какой используется донор-хозяин. Например, штамм 2 (табл. 14.1) имеет делецию в месте нормальной интеграции профага Х\ в этом случае фаг X включается с низкой частотой в другие, несвойственные для него места, разбросанные по всей хромосоме. Индукция таких лизогенных бактерий приводит к формированию трансдуцирующих фагов, несущих почти любой желаемый ген ,[35]. Этот подход может быть использован и для других фагов Е. coli, осуществляющих специфическую трансдукцию, а также для фагов, размножающихся в других видах бактерий. Многие из методов, позволяющих реализовать эти подходы и другие возможности использования фагов, способных к специфической трансдукции, описаны Миллером [2].

14.2.2. Общая трансдукция

(Е. coll — бактериофаг Р1)

Штаммы бактерии и фага

Бактериофаг Р1 представляет собой вирус, осуществляющий общую трансдукцию на чрезвычайно широком круге хозяев. Не представляет труда выделить мутант фага Р1, который с большой эффективностью размножается приблизительно на 70% штаммов Е. coli, полученных из клинического материала, а также мутанты, легко инфицирующие штаммы родов Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella и Citrobacter [17].

Благодаря этому свойству, а также тому, что фаг Р1 может трансдуцировать фрагменты донорной ДНК, по мол. массе доходящие до 60-Ю6, этот трансдуцирующий фаг очень полезен. Однако по сравнению с другими часто используемыми колифагами фаг Р1 медленней адсорбируется на бактериях, образует очень маленькие стерильные пятна и дает лизаты, которые стабильны только при условии, что абсолютно лишены остатков бактериальных клеток. Фаг PI kc [24], являющийся производным фага Р1, с высокой эффективностью заражает штамм Е. coli К-12 и образует относительно прозрачные стерильные пятна, что облегчает его определение. Однако PI kc способен лизогенизировать бактерию-хозяина. Фаг PI L4 [8] представляет собой мутантную форму фага PI kc с мутацией в гене репрессора CI, которая делает его не способным к лизогенизации.

Несмотря на то что для трансдукции фагом Р1 могут быть использованы многие донорные и реципиентные штаммы Е. coli К-12, принципы работы с ним удобно показать на системе, позволяющей простую демонстрацию совместной трансдукции (котрансдукции). Для этого донорный штамм (штамм 7, табл. 14.1) должен иметь мутацию lacZ, обусловливающую неспособность синтезировать р-галактозид

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.08.2019)