Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

Таким образом, эти фаги представляют собой рекомбинанты, содержащие как собственную, так и генетическую информацию клетки-донора. При инфекции и лизогенизации определенного реципиентного штамма фагами, способными к специфической трансдукции, клетки этого штамма находятся в состоянии частичной диплоидии, когда имеется и генетическая информация донора, содержащаяся в трансдуцирующем фаге, и гомологичная генетическая информация в хромосоме реципиента. Если генетическая информация донора заменяет в фаге, осуществляющем специфическую трансдукцию, генетическую информацию, жизненно необходимую для размножения фага, трансду-цирующий фаг становится дефектным и неспособным к размножению и развитию в отсутствие интактного генома фага-помощника. В некоторых случаях, однако, фаг, способный к специфической трансдукции, не теряет главных функций, он может нормально осуществлять продуктивный литический цикл и образовывать стерильные пятна.

В наиболее изученных системах образование фагов, участвующих в общей трансдукции, сопровождается случайной упаковкой донорного генетического материала вместо фагового. Поэтому фаговые частицы, способные трансдуцировать ДНК донора, полностью дефектны. Ре-ципиентная клетка, инфицированная такой частицей, в отсутствие одновременной множественной инфекции нормальными фаговыми частицами приобретает только генетический материал донора, но не фага. Проникнув в реципиентную клетку, генетическая информация донора (если она хромосомного происхождения) интегрирует и заменяет генетическую информацию реципиента или существует отдельно без интеграции и репликации; образуются так называемые абортивные трансдуктанты. Фаги, осуществляющие общую трансдукцию, способны также включать в себя и траисдуцировать генетическую информацию плазмид. Последние могут приживаться в клетке-реципиенте и начинают реплицироваться синхронно с хромосомой реципиента.

При изучении трансдукции необходимо, чтобы донор и реципиент различались в отношении соответствующих легко распознаваемых генетических признаков. Обычно реципиент несет мутации, делающие его неспособным синтезировать какой-нибудь метаболит или использовать какой-нибудь источник углерода. Реципиент может также обладать признаком дикого типа, обусловливающим чувствительность к какому-либо антибиотику, препарату или фагу. Клетка-донор должна иметь противоположный аллель, по которому легче всего вести отбор в случае наследования этого признака трансдуктантами.

Общие методы

Чтобы получить специфически трансдуцирующие ли-заты, нужен штамм донора, лизогенного по отношению к трансдуцирующему фагу. В зависимости от конкретной системы лизат можно приготовить индукцией штам-ма-лизогена ультрафиолетом или митомицином С; еще лучше, если у этого штамма имеется профаг, индуцируемый тепловой обработкой, для которого лизогения стабильно поддерживается при 30 °С, а литическая реакция индуцируется обработкой при температуре 37°С [19]. Чтобы получить лизаты для общей трансдукции, инфицированные бактерии-доноры обычно выращивают в жидкой среде или высевают в чашки методом наслоения мягкого агара, где наблюдается сплошной лизис [2]. Для обеспечения максимального выхода фага и в том и в другом случае выращивать и инфицировать бактерий нужно в среде с соответствующими концентрациями катионов. В большинстве случаев лизаты трансдуцирую-щих фагов хранят над хлороформом, который убивает все неинфицированные и неиндуцированные клетки донора.

Условия, обеспечивающие оптимальное инфицирование реципиентного штамма, зависят от используемой системы фаг — хозяин; особое внимание при этом уделяется содержанию ионов в среде и способам выращивания реципиента. В большинстве систем перед посевом с целью отбора трансдуктантов проводят предварительную адсорбцию фага на реципиентных клетках. Поскольку большинство фагов в трансдуцирующем лизате обладает инфекционностью и способно убить реципиентные клетки, применяются методы, позволяющие избегать инфекции и гибели трансдуцированных клеток. Легче всего этого достигают, если используют реципиент, лизо-генный по трансдуцирующему фагу, так как лизогенные клетки иммунны к суперинфицированию гомологичным фагом. Можно также использовать такое количество фаговых частиц, чтобы на одну клетку приходилось меньше одной фаговой частицы. Этим сводится к минимуму возможность множественного инфицирования. Затем, по прохождении этапа предварительной адсорбции, добавляют либо фаговую антисыворотку, либо, если фаг нуждается для адсорбции в двухвалентных катионах, хелатобразующий агент. С помощью обоих последних приемов в основном предотвращают инфицирование потенциальных трансдуктантов фагом, высвободившимся из реципиентных клеток, которые были подвергнуты продуктивной инфекции.

Трансдуктанты выявляют и пересчитывают, высевая их на соответствующие селективные среды. В том случае, когда признак донора, по которому ведут отбор, рецессивен по отношению к аллелю реципиента и (или) обусловливает устойчивость к какому-либо бактерицидному агенту или веществу, посев делают не сразу, чтобы могла произойти сегрегация соответствующих признаков и они успели бы фенотипически проявиться.

14.2.1. Специфическая трансдукция

(Е. coli бактериофагом X)

Штаммы бактерии и фага

Ввиду того что фаг X обычно включается в хромосому Е. coli между генами gal и Ыо, в норме этим фагом трансдуцируются генетические признаки, детерминируемые именно этими генами [4, 18, 22]. Трансдукцию можно продемонстрировать, взяв нелизогенный реципиент-ный штамм с мутацией в гене gal, например штамм 6 (табл. 14.1) и штамм донора gal+f например штамм 5 (табл. 14.1), подвергаемый лизогенизации фагом X с1857. Последний несет мутацию, делающую температу-рочувствительным репрессорный белок, необходимый для наступления и поддержания лизогенного состояния: бактериальный штамм остается лизогениым, пока растет при 30 °С, но индуцируется и лизируется с высвобождением фага, если выращивается при 37°С.

Среды

Используют супер-бульон (разд. 14.4.3), содержащий 10 мМ Mg2+, лямбда-агар, или мягкий агар (разд. 14.4.2), агар ЕМВ (разд. 14.4.5) + 1% галактозы (ЕМВ-f-Gal) или агар ЕМВ без добавок углеводов (ЕМВО), минимальный агар VB (разд. 14.4.6) +0,5% галактозы (МА + + GaI) (и любые другие добавки, требуемые для роста данного реципиента) и водный раствор 10 мМ MgCl2 (или MgS04).

Приготовление лизата трансдуцирующего фага

Лизат трансдуцирующего фага легче всего приготовить следующим образом: сначала лизогенизировать до-норный штамм фагом X с1857, а затем вызвать его лизис.

1. Выращивают несколько миллилитров культуры донора в супер-бульоне при 37°С до титра, приблизительно равного 1 -10s—2-Ю8 клетка/мл.

2, Добавляют около 200 мкл этой культуры к 2 мл

расплавленного мягкого лямбда-агара, находящегося

при 45 °С, и немедленно выливают содержимое на поверхность лямбда-агара в чашке. Быстрыми движениями вперед-назад смесь с мягким агаром равномерно распределяют по чашке и оставляют на несколько минут при комнатной температуре до затвердения нанесенного слоя агара. (Чашки с лямбда-агаром нужно довести до комнатной температуры или даже слегка подогреть, так как на холодном нижнем слое агара мягкий агар может затвердеть еще до того, как он равномерно распределится по поверхности.)

3. В центр чашки наносят две капли Я с1857-фаголи-зата, в которых содержится 109—-1010 пятнообразующих единиц (ПОЕ) в 1 мл. (Если Я-фаголизат хранился над хлороформом, то остатки последнего перед использованием удаляют инкубацией проб при 37 °С с пропусканием время от времени пузырьков воздуха до тех пор, пока не будут больше выявляться пары хлороформа.) Крышку чашки Петри оставляют слегка приоткрытой до того момента, как нанесенные капли впитаются в агар. Чашку переворачивают и инкубируют при 30°С в течение ночи. На следующий день на поверхности агара вырастает сплошной бактериальный газон с большим пятном в центре, вызванным лизисом некоторых клеток, инфицированных фагом Я с1857. Центр этого пятна, однако, будет замутнен вследствие выживания и роста донорных клеток, которые лизогенизировались фагом К cl857.

4. Стерильной зубочисткой, деревянной палочкой или петлей отбирают некоторые колонии из замутненных областей роста в центре пятна и вносят их в супер-бульон (10 мл), находящийся в стерильной колбе Эрленмейера объемом 125 мл.

5. Инкубируют эту культуру при 30 °С со встряхиванием и вращением колбы, чтобы добиться хорошей аэрации. Когда концентрация культуры достигает примерно 2-Ю8 клетка/мл, увеличивают температуру инкубации до 45 °С на 1—2 мин и затем вновь снижают до 37°С. Продолжают инкубацию с аэрацией приблизительно 2 ч; за это время лизис должен пройти полностью.

6. Добавляют каплю СНСЬ, энергично встряхивают, чтобы она хорошо диспергировалась, и продолжают встряхивание при 37 °С в течение 10—15 мин.

7. Остатки бактерий удаляют из лизата центрифугированием при 6000—7000 g в течение 5—10 мин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную колбу или пробирку с завинчивающейся крышкой и добавляют еще одну каплю СНСЬ.

Определение титра фага

Полученный X с1857-фаголизат должен иметь титр около 1010 ПОЕ/мл; точно его определяют следующим образом.

1. Выращивают культуру в объеме 10 мл—либо не-лизогенного штамма-донора, либо штамма-реципиента— в супер-бульоне с аэрацией пропусканием пузырьков воздуха или встряхиванием при 37 °С до титра МО8—2-108 клетка/мл.

2. Осаждают клетки культуры центрифугированием при 6000—7000 g в течение 5—10 мин и осадок суспендируют в 10 мМ MgCh.

3. Вновь осаждают клетки так же, как и на этапе промывания, и суспендируют осадок в 10 мл 10 мМ MgCh.

4. Оставляют суспензию в стерильной колбе Эрлен-мейера при 37 °С в режиме голодания на 60 мин со встряхиванием.

5. Вносят в стерильные пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм аликвоты суспензии объемом 1,9 мл и инкубируют их при 37 °С.

6. Делают последовательные десятикратные разведения Я-фаголизата раствором 10 мМ MgCb.

7. Добавляют в пробирки с находящимися в них при 37°С аликвотами бактериальной суспензии по 100 мкл одного из следующих разве

страница 14
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)