популяции реципиента абсолютного количества компетентных клеток, способных включать ДНК донора, используют радиоактивно меченную до-порную ДНК с последующей радиоавтографией или математический анализ данных, касающихся зависимости частот трансформации двух несцепленных донорных маркеров, совместно и порознь, от концентрации ДНК донора. В общих чертах эти методы обсуждаются в работах Хейеса [18], а также Нотани и Сетлоу [31].

14.1.4. Трансформация у Е. coli

Мандель и Хига [28] обнаружили, что обработка клеток Е. coli СаСЬ с последующими инкубацией на холоду и тепловым шоком приводит к включению ДНК, добавленной в среду. Их результаты дали толчок к разработке ряда приемов, позволяющих индуцировать состояние компетентности у бактерий различных родов и тем самым осуществлять трансформацию хромосомной и плазмидной ДНК, а также реализовать возможность трансфекции с помощью ДНК бактериофагов.

Бактериальные штаммы

В табл. 14.1 перечислены штаммы Е. coll К-12, которые могут служить донорами и реципиентами в экспериментах по трансформации, а также трансдукции и конъюгации. Помимо генотипических различий между штаммами донора и реципиента, часто для улучшения споГенетическая номенклатура соответствует номенклатуре, предложенной Демерецем и др [14]; использованы условные знаки и символы хромосомных и плазмидных признаков в соответствии с работами Бахмаи и др [5] и Новика и др. [32].

собности к трансформации используются дополнительные мутации у штаммов реципиента. У Е. coli К-12 деления галактозного оперона (мутации Agal), как, например, в штамме 2, приводит к удалению галактозы из липололисахаридной оболочки и значительно усиливает способность штаммов к трансформации плазмидной

ДНК и способность к трансфекции ДНК фага Л, но не фагов Т1 и Т7. Мутация end А, имеющаяся у штамма 3, приводит к исчезновению периплазматической эндонук-леазы I и очень сильно стимулирует трансформацию плазмидной ДНК, но почти не влияет на трансформацию линейными молекулами ДНК. Кослой и Оиши [9] обнаружили, что исчезновение экзонуклеазы V и экзонуклеа-зы I у штаммов recB, recC, sbcB, например у штамма 4, облегчает трансформацию Е. coli хромосомной ДНК и усиливает трансфекцию ДНК фагов Т1 и Т7, но не ДНК фага К. В то же время эти мутации не влияют или почти не влияют на трансформацию плазмидной ДНКСреды

В качестве комплексных сред используют L-бульон и L-arap (разд. 14.4.1) или бульон и агар Penassay (разд. 14.4.4). Можно также использовать различные минимальные среды, в том числе среду М9 [4], среду VB-E [37] и среду ML [10]. Для превращения среды в твердую добавляют 1,5% агара. В зависимости от генотипа используемого реципиентного штамма добавляют дс оптимальных концентраций (табл. 14.4) аминокислоты, пурины, пиримидины и витамины. Источники углерода обычно добавляют в конечной концентрации 0,5% (табл. 14.3); концентрация антибиотиков зависит от степени устойчивости, привносимой соответствующими мутациями и (или) генами (табл. 14.5). Методы приготовления сред см. в разд. 14,4.

Выделение ДНК

Хромосомную ДНК штаммов донора, таких, как штамм 1 (табл. 14.1), лучше всего выделять по методу Мармура ([29]; разд. 22.2.1). Для получения активных в отношении трансформации препаратов ДНК последние этапы выделения, на которых удаляются остатки РНК, проводить не обязательно. ДНК плазмиды pYA13 можно выделить из штамма 1 и использовать для трансформации. Плазмидную ДНК выделяют методами, описанными в гл. 15.

Осуществление трансформации

Описано большое число модификаций оригинальной методики Манделя и Хиги [28]. Мы считаем, однако, что наиболее эффективным является метод трансформации или трансфекции разнообразными хромосомными ДНК, а также ДНК фагов и плазмид, разработанный в нашей лаборатории на множестве реципиентных штаммов Е. coli К-12 Гиллом и Александер. Он представляет собой модификацию метода, впервые использованного Эниа с соавторами [15], и ниже мы приводим его описание.

1. Выращивают культуру реципиентного штамма в объеме 5 мл в течение ночи в L-бульоне (разд. 14.4.1) при 37 °С без перемешивания. Культуры, выращенные без принудительной аэрации, при продолжении культивирования на следующий день имеют значительно более короткую лаг-фазу перед началом экспоненциального роста по сравнению с аэрированными в течение ночи культурами, уже достигшими стационарной фазы роста.

2. Разводят культуру (1 : 100) в 40 мл L-бульона и инкубируют с аэрацией (либо пропусканием пузырьков воздуха, либо встряхиванием) при 37 °С до достижения клетками ранней логарифмической фазы (МО8— 2-108 клетка/мл).

3. Охлаждают культуру во льду и осаждают клетки центрифугированием при 7000 g при 4°С.

4. Осторожно суспендируют клеточный осадок в 10 мл охлажденного во льду буфера, имеющего состав: 10 мМ NaCI, 50 мМ МпС12, 10 мМ ацетат натрия, рН5,б.

5. Оставляют суспензию во льду на 20 мин и затем осаждают клетки центрифугированием.

6. Осторожно суспендируют клеточный осадок в 1 — 2 мл охлажденного во льду буфера, имеющего следующий состав: 75 мМ СаС12, 100 мМ МпС12, 10 мМ ацетат натрия, рН 5,6. (В зависимости от конкретного штамма реципиента и типа используемой ДНК можно изменять концентрацию СаС12 в пределах от 25 до 100 мМ и концентрацию МпСЬ от 50 до 200 мМ.)

7. Вносят пробы компетентных клеток объемом 200 мкл каждая в охлажденные пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм.

8. Добавляют к каждой пробе компетентных клеток 1 — 10 нг плазмидной или фаговой ДНК или 100—1000 нг хромосомной ДНК- Если ДНК донора находится в объеме, меньшем чем 20 мкл, то буфер, в котором она растворена, не окажет влияния на результат; однако в случае объема, большего чем 20 мкл, ДНК следует разводить СаСЬ — МпСЬ — Na-ацетатным буфером, рН 5,6, в котором суспендированы компетентные клетки.

9. Выдерживают смесь, содержащую ДНК и компетентные клетки во льду в холодной комнате в течение примерно 30 мин.

10. Подвергают смесь тепловому шоку при 30 °С в течение 2,5 мин. Важна быстрая смена температуры; сама же температура шока и его длительность различны в зависимости от свойств реципиентного штамма. Например, 2 мин при 37 °С или 1 мин при 42 °С могут оказаться более эффективными, чем 2,5 мин при 30 °С.

11. Вслед за тепловым шоком смесь нейтрализуют до рН 7,0 добавлением 3 мкл 2 М триса, рН 7,4.

12. Если донорный маркер, по которому ведется отбор, обусловливает устойчивость к антибиотику (в особенности бактерицидному), смесь разводят 1 : 10 ростовой средой и инкубируют при 37 °С в течение 60—90 мин для экспрессии маркера устойчивости.

13. Высевают смесь (разведенную или неразведен-ную в зависимости от типа взятой ДНК, а также от того, разводили ее или нет для выявления экспрессии) на среду, позволяющую отобрать трансформированные клетки, и в соответствующем разведении на неселективную среду для определения выживаемости. Так как обработка клеток СаСЬ делает их непрочными, следует использовать свежеприготовленную, не сильно подсохшую среду. Важно также не допускать высыхания засеваемого материала: после распределения разведенной суспензии по поверхности агара дают ей впитаться в агар, приоткрыв слегка крышку чашки Петри на несколько минут.

14. Чашки инкубируют 1—2 сут при 37 °С в соответствующем режиме, зависящем от маркера, по которому ведется отбор, и от скорости роста реципиентного штамма.

Применение

Трансформация — важный метод генетического анализа, так как имеющиеся в природе способные к трансформации виды не имеют систем конъюгации, и только небольшое число видов имеет хорошо развитые системы трансдукции. В аспекте фундаментальной науки трансформация позволила составить представление о механизме генетической рекомбинации [25, 31], а в случае Bacillus subtilis ее изучение способствовало получению информации о начале и направлении репликации хромосомы [18]. Данные экспериментов по внутривидовой и межвидовой трансформации использовались также для определения степени генетического родства между определенными участками генома [31]. Такой подход стимулировал изучение родства с использованием анализа кинетики реассоциации ДНК (гл. 22) и новейших методических приемов при исследовании рекомбинантной ДНК. Использование трансформации и трансдукции тесно связано с методологией изучения рекомбинантной ДНК, где благодаря искусственной индукции компетентности возможно введение рекомбинантных молекул в клетки различных видов бактерий.

14.2. ТРАНСДУКЦИЯ

Бактериальные вирусы делят на вирулентные, при инфицировании которыми все зараженные клетки гибнут с высвобождением новых фаговых частиц, и умеренные, вызывающие либо лизис инфицированных бактерий с высвобождением потомства новых фагов, либо их лизо-генизацию [4]. В лизогенном состоянии фаговый геном, называемый уже профагом, реплицируется синхронно с бактериальной хромосомой в форме плазмиды или включаясь в хромосому. Несмотря на то что вирулентные фаги и вирулентные мутанты умеренных фагов способны к трансдукции, в природе основной приток генов в бактерии за счет трансдукции обусловлен лизогенными умеренными фагами, которые представляют собой наиболее простые системы для изучения.

Известны два типа трансдукции — специфическая и общая [18]. В случае специфической трансдукции могут передаваться лишь генетические маркеры донора, прилежащие к интегрированному профагу. Под общей трансдукцией понимают передачу любого признака донора независимо от того, расположены ли его детерминанты в хромосоме, плазмиде или профаге. В соответствии с этим специфическая трансдукция наблюдается только в том случае, когда фаговый лизат получают путем спонтанного или индуцированного высвобождения фага из лизогенного донора, и никогда — в случае размножения фага в ходе литического продуктивного цикла. Вместе с тем в случае фагов, способных к общей трансдукции, генетическая информация донора может извлекаться как после индукции культуры лизогенного донора, так и в результате литического продуктивного цикла. Фаги, осуществляющие специфическую трансдук-цию, содержат участки генетического материала донора, заместившие участки фагового генома.