Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 2

Автор Ф.Герхардт

трансформации мутации trpA с аллелем trpB+ донора, в то время как большие колонии — вследствие трансформации только аллеля trpB+ донора.

Штаммы

Штаммы как донора, так и реципиента были выделены из штамма BD413 — мутанта с недоразвитой капсулой, полученного из штамма BD4 дикого типа A. calcoaceticus, способного к трансформации [23]. До-норный штамм имеет мутацию trpA23, а реципиент-ный — мутацию trpB18 [34]. Эти штаммы растут при температуре от 30 до 35°С и хранятся при 4°С на скошенном L-arape. Пересевы на свежую среду должны производиться каждые 2 мес.

Среды

A. calcoaceticus можно культивировать на разнообразных полных средах, таких, как L-бульон или L-arap, бульон и агар Penassay, сердечно-мозговой бульон или агар. Можно также использовать различные минимальные среды, годится и среда VB-E. Работая с мутантами trpB и trpA, для стимуляции роста прототрофных реком-бинантов и одневременного предотвращения роста мутантов можно использовать кислотный гидролизат казеина, например казаминовые кислоты (0,5%), так как в процессе кислотного гидролиза триптофан разрушается. Методы приготовления сред см. в разд. 14.4.

Выделение ДНК методом Мармура [29]

ДНК донорного штамма trpA выделяют по Мармуру (разд. 22.2.1) или одним из простых способов, описанных ниже.

Выделение ДНК методом Савулы и Кроуфорда [34]

1. Выращивают клетки-доноры с использованием аэрации при 30—35 °С до ранней стационарной фазы в 10 мл L-бульона (разд. 14.4.1). Аэрацию осуществляют, применяя либо пробулькивание пузырьков воздуха через среду в пробирках (пробирки диаметром 25 и высотой 200 мм, снабженные стеклянной палочкой с поперечником 4—5 мм; палочку облегает резиновая трубка, которая выходит через завинчивающуюся крышку пробирки; пробирку подсоединяют к аквариумному насосу с соблюдением правил стерилизации продуваемого воздуха), либо встряхивание на качалке в колбах, погруженных в водяную баню.

2. Клетки осаждают центрифугированием и суспендируют в 2,4 мл солевого буфера с ЭДТА (0,15 М NaCl, 0,1 М ЭДТА, рН 8,0).

3. Добавляют 100 мкл 6%-ного додецилсульфата натрия и инкубируют суспензию 10 мин при 37 °С для обеспечения лизиса клеток.

4. Осветляют лизат добавлением 50 мкл 5 М КС1 и после охлаждения во льду центрифугируют 20 мин при 39 000 g.

5. Нагревают надосадочную жидкость, содержащую ДНК, при 50—60 °С в течение 5 мин, чтобы убить все оставшиеся клетки.

6. Проверяют стерильность препарата посевом пробы в чашку с L-агаром (разд. 14.4.1), которую инкубируют ночь при 30—39 °С.

7. Если нужно, осаждают ДНК добавлением двух объемов холодного этанола и наматывают ее на стеклянную палочку с маленьким крючком на конце (разд. 22.2.1). Растворяют ДНК в цитратносолевом буфере.

8. Определяют концентрацию ДНК цветной пробой с дифениламином (разд. 22.4.3), так как в полученном препарате могут содержаться РНК и другие примеси, поглощающие в ультрафиолете.

9. Хранят препарат ДНК при 4°С.

Выделение ДНК упрощенным методом Юни [22]

1. Отбирают петлей выросшую на скошенном агаре или на агаре в чашке бактериальную биомассу и суспендируют клетки в маленькой пробирке в 0,5 мл стерильного раствора, содержащего 0,15 М NaCl, 0,015 М трехзамещенный лимоннокислый натрий и 0,05%-ный додецилсульфат натрия.

2. Прогревают суспензию при 60—65 °С в течение 1 ч.

3. Неочищенный лизат хранят при 4°С. Он сохраняет стабильность в отношении трансформирующей активности по крайней мере в течение года.

Осуществление трансформации

1. Выращивают реципиентный штамм trpB в L-бульоне (разд. 14.4.1) в течение ночи при 35 °С, применяя аэрацию. (Л. calcoaceticus может расти при любой температуре в интервале 30—37°С; несколько ускоренный рост наблюдается при 35 °С.)

2. Разводят культуру в 10 раз свежим подогретым L-бульоном и аэрируют ее либо пропусканием пузырьков воздуха, либо на качалке в течение 2 ч при 35 °С.

3. В каждую чашку с минимальным агаром VB (разд. 14.4.6) (дополненным 0,5% казаминовых кислот, 0,5% глюкозы и 5 мкг/мл индола) вносят 100 мкл компетентной культуры реципиента и различные количества препарата ДНК донора (возрастающие количества от 10 до 200 мкл, или 20—500 мкг).

4. Немедленно смешивают оба препарата и распределяют их равномерно по поверхности агара стеклянным шпателем, предварительно промытым в этаноле, флам-бированным и охлажденным.

5. В качестве контроля наносят и равномерно распределяют 100 мкл популяции клеток реципиента в чашку с селективной средой, чтобы убедиться в отсутствии ревертантов trpB+ или других посторонних бактерий.

6. Как дополнительный контроль наносят на агар и равномерно распределяют 100 мкл препарата ДНК донора в чашку с селективной средой, чтобы убедиться в отсутствии посторонних микроорганизмов.

7. Добавляют 10 мкл ДНКазы с концентрацией 100 мкг/мл в 0,2 М MgCl2 к 100 мкл препарата донор-ной ДНК (находящейся в цитратносолевом буфере) примерно за 2—3 мин до смешивания на селективной среде со 100 мкл суспензии компетентных реципиентных клеток. Этот контроль должен подтвердить, что расщепление ДНК приводит к исчезновению колоний трансформантов.

8. Все чашки переворачивают и инкубируют ночь при 35 °С или до тех пор, пока колонии не станут ясно различимыми.

9. Просматривают чашки и, не повреждая колоний, подсчитывают общее число маленьких и больших колоний в каждой чашке.

10. Выделяют чистую культуру из нескольких маленьких колоний, чтобы определить, действительно ли

свойства их клеток соответствуют фенотипам ожидаемых котрансформантов trpA23 trpB+ (т. е. они продолжают зависеть от триптофана или индола и образуют

большие колонии на средах, содержащих 40 мкг/мл индола). Выделяют чистую культуру из больших колоний,

чтобы определить, действительно ли их рост не зависит

от индола или триптофана. Это делают следующим образом.

а) Отбирают 10—20 отдельных колоний каждого типа (используя либо стерильные зубочистки, либо стерильные бактериальные иглы) в 1—2 мл солевого буфера с желатиной (СБЖ; разд. 14.4.7),

находящегося в пробирках диаметром 13 и высотой 100 мм, или

в микрокапельки СБЖ на стенках пластмассовой чашки Петри.

б) Высевают эти суспензии штрихом в чашки с селективной агаровой средой так же, как в случае получения отдельных колоний.

Это делают с помощью стерильной иглы, если колонии суспендировали в очень маленьком объеме СБЖ, или с помощью стерильной

бактериальной петли, забирая ею как можно больший объем суспензии со стеики пробирки, если колонии суспендировали в 1—2 мл

СБЖ. Чашки с селективным агаром разделяют на 4—10 мелких секторов, чтобы иметь возможность очистить 4—10 образцов в одной

чашке.

в) Инкубируют чашки при 35 °С в течение 1—2 сут.

г) Отбирают в СБЖ обособленные колонии, происходящие из

отдельных трансформантов; полученные суспензии высевают штрихом

на минимальный агар с добавкой 5 мкг/мл индола, 40 мкг/мл индола, 10 мкг/мл триптофана и на минимальный агар без добавок. Чашки инкубируют при 35 °С.

11. Анализируют результаты для того, чтобы определить, возрастает ли общее число трансформантов пропорционально количеству взятой в опыт ДНК донора. Обычно эта зависимость соблюдается; лишь в области высоких концентраций ДНК может наступать насыщение.

12. Вычисляют частоту котрансформации аллелей trpA23 и trpB+ и определяют, насколько эта величина постоянна и не зависит от концентрации ДНК.

Модификации и другие эксперименты по трансформации с Л. calcoaceticus

Вышеописанный метод можно сделать количественным, если добавлять известные количества донорной ДНК (1—500 нг/мл) к жидким культурам компетентных реципиентных клеток с концентрацией МО8—2 -108 клетка/мл. После инкубации в течение 10—15 мин при 35°С для остановки реакции добавляют на 1 мл смеси 10 мкл ДНКазы, растворенной в 1 М MgCh в концентрации 0,5 мг/мл. Соответствующие разведения высевают на селективную среду и затем строят график зависимости абсолютного титра трансформантов от концентрации ДНК в логарифмических координатах.

Можно также определить стадию в цикле роста культуры, когда компетентность реципиента максимальна. Для этого вносят небольшие изменения в метод простой трансформации в чашке или применяют более количественный метод, описанный в предыдущем абзаце. В таком эксперименте следует в каждой пробе использовать одну и ту же концентрацию (или число) клеток реципиента. Для повышения точности такого эксперимента прежде всего нужно построить кривую роста ре-ципиентного штамма в L-бульоне (разд. 14.4.1) при 35 °С с аэрацией. В общих чертах методика определения зависимости частоты трансформации от стадии роста заключается в следующем. Клетки стационарной проинкубированной с аэрацией в течение ночи культуры осаждают центрифугированием и суспендируют в той же концентрации в свежем L-бульоне. Титр суспензии определяют посевом соответствующего разведения на L-arap (разд. 14.4.1). Делают разведения суспензии 1:5, 1:10, 1 :20, 1 :40 и 1 :80 в колбах с L-бульоном и инкубируют при 35 °С со встряхиванием. Через 15 и 30 мин отбирают пробы из разведения 1:5 и добавляют к ним донорную ДНК в насыщающей концентрации; эти пробы служат для оценки компетентности клеток в ранней, средней и поздней лаг-фазе. Пробы из разведений 1:10, 1:20, 1:40 и 1 : 80 отбирают по достижении той оптической плотности, которая характерна для исходной культуры, разведенной 1:5; по ним оцениваются различные стадии логарифмической фазы роста. Культуру разведения 1 :80 можно дорастить до больших плотностей, чтобы оценить компетентность клеток в поздней логарифмической, ранней стационарной и стационарной фазах. Однако перед добавлением ДНК такие пробы разводят до соответствующей стандартной плотности. К моменту добавления донорной ДНК для каждой пробы должно быть подсчитано число жизнеспособных реципиентных клеток. Зная эти цифры и начальные разведения, строят кривую роста и на этом же графике откладывают для каждой точки частоту трансформации. Максимум компетентности должен находиться в интервалах от поздней лаг- до ранней логарифмической фазы и от поздней логарифмической до ранней стационарной фазы.

Для определения в

страница 12
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 2" (4.15Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)