ou G. Isolation of spontaneous mutant strains of Pseudomonas putida. Biochem. Biophys. Res. Com-mun., 36, 179—184 (1969).

22. Osbom M., Person S., Phillips S., Funk F. A determination of mutagen specificity in bacteria using nonsense mutants of bacteriophage T4. J. Mol. Biol, 26, 437—447 (1967).

23. Prakash L., Sherman F. Mutagenic specificity: reversion of iso-1-cytochrome с mutants of yeast. J. Mol. Biol., 79, 65—82 (1973).

24. Szybalski W. Microbial selection. I. Gradient plate technique for study of bacterial resistance, Science, 116, 46—48 (1952).

25. Willets N. 5., Clark Л. J., Low К- B. Genetic location of certain mutations conferring recombination deficiency in Escherichia coll. J. Bacteriol., 97, 244—249 (1969).

Глава 14

ПЕРЕНОС ГЕНОВ Р. Кёртис III

Обычно рассматривают три тина переноса генов у бактерий. Первый тип — трансформация — это такой процесс, при котором ДНК одной бактерии — донора переходит в другую бактерию — реципиент. Реципиент-ная клетка, в которой происходит экспрессия генетических признаков донора, называется трансформантом. Второй тип — трансдукция— это процесс генного переноса, при котором бактериальный вирус (бактериофаг), размножающийся в клетках бактериального штамма-донора, включает в себя часть генетической информации бактерии и после инфицирования другого, реципиент-ного, штамма вызывает иногда наследуемые изменения у последнего. Реципиентная клетка, которая таким путем приобретает признаки донора, называется трансдук-тантом. Третий тип переноса — конъюгация — это процесс, при котором клетки бактериального штамма-донора вступают в непосредственный механический контакт с клетками реципиентного штамма и передают последнему генетический материал. Реципиент, который получает этот материал, называется трансконъюгантом. Наряду с процессом мутирования генов трансформация, трансдукция и конъюгация играют важную роль в появлении новых типов бактерий. Эти процессы очень важны также потому, что они позволяют исследователям, занимающимся бактериальной генетикой, выяснять биохимические и генетические аспекты функционирования бактерий, устанавливать принципы строения, функционирования и регуляции генов, а также более сложных процессов синтеза макромолекул, роста и деления клеток.

14.1. ТРАНСФОРМАЦИЯ

Трансформация хорошо известна и подробно изучена для некоторых штаммов Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis, Streptococcus sanguts, Neisseria gonorrhoeae, Aclnetobacter catcoaceticus [25, 31, 36]. Способность или неспособность к трансформации для любого бактериального штамма зависит от его компетентности, под которой понимают способность реципиентного штамма включать ДНК из культураль-ной среды внутрь клетки.

Трансфекция — процесс, аналогичный трансформации, при котором выделенная ДНК бактериального вируса, будучи внесенной в культуру компетентного реципиента, обусловливает образование фаговых частиц. В тех случаях, когда в компетентную реципиентную клетку не попадает фаговый геном весь целиком, для его образования необходимо, чтобы в клетке-реципиенте прошла рекомбинация проникших в нее нескольких неполных фаговых хромосом.

Успешное осуществление трансформации определяется использованием высокомолекулярной двухцепочечиой ДНК и созданием специфичных условий, в которых популяция реципиентных клеток проявляет максимальную компетентность. Последнее часто зависит от таких факторов, как стадия в цикле роста популяции реципиента, питательная ценность культуральной среды, уровень аэрации, рН, наличие нужных концентраций двухвалентных катионов и в большинстве случаев генотип реципиента.

В отношении последнего свойства среди наиболее важных моментов укажем структуру клеточной поверхности, образование факторов компетентности, способность подвергаться автолизу и присутствие или отсутствие профагов (умеренных бактериальных вирусов, геном которых реплицируется синхронно с геномом бактерии-хозяина).

При изучении трансформации необходимо, чтобы штаммы донора и реципиента различались по легко распознаваемым генетическим признакам. Как правило, используются реципиенты, несущие мутации, которые обусловливают неспособность синтезировать какой-либо метаболит или утилизировать какой-либо источник углерода, или же реципиенты с признаками дикого типа, чувствительные к некоторым антибиотикам, химическим препаратам или фагам. Доноры же должны иметь противоположные аллели, которые легко выявляются в том случае, если трансформант их унаследовал. Методы выделения и определения характеристик му-тантных штаммов описаны в гл. 13.

14.1.1. Выделение ДНК

Оптимальный метод выделения высокомолекулярной ДНК из донорного штамма или трансфецирующей ДНК бактериального вируса часто зависит от особенностей соответствующих бактерий ил if вирусов. Общие принципы и методы разрушения клеток грамотрицатель-ных и грамположительных бактерий с целью выделения ДНК приведены в гл. 22. Чаще других для выделения и очистки высокомолекулярной ДНК из микроорганизмов применяется метод, описанный Мармуром [29]. Он подробно изложен в разд. 22.2.1. Однако в большинстве случаев использование высокоочищенных препаратов ДНК, не содержащих РНК и другие примеси, необязательно; поэтому можно обойтись без обработки рибо-нуклеазой. Специальные методы выделения ДНК плазмид описаны в гл. 15.

Для всех методов выделения ДНК характерна обязательная инактивация бактериальных дезоксирибо-нуклеаз. В связи с этим трансформирующую ДНК обычно суспендируют в буфере, содержащем соли лимонной кислоты или натриевую соль ЭДТА. Эти соли образуют хелатные комплексы с двухвалентными катионами, такими, как магний, представляющими собой необходимые кофакторы для большинства дезоксирибонуклеаз. Препараты ДНК обычно хранят в стандартном цитратносо-левом буфере (0,15 М NaCI, 0,015 М трехзамещенный цитрат натрия, рН 7,0) или, в случае плазмидных и фаговых ДНК, для которых важно поддержание суперспи-рализованной кольцевой конфигурации, в буфере 10 мМ трис — 1мМ ЭДТА, рН 8,0.

14.1.2. Количественное определение ДНК

Количество очищенной ДНК (не содержащей РНК и других примесей, поглощающих в ультрафиолете) можно определить, измерив ее концентрацию спектрофо-тометрически. Оптическая плотность при 260 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см, поделенная на 20, дает концентрацию ДНК в мг/мл. Таким образом, для концентрации ДНК 50 мкг/мл А2бо = 1Д Для оценки чистоты препарата ДНК можно измерять оптическую плотность при 234, 270 и 280 нм и соотносить ее с оптической плотностью при 260 нм (разд. 22.4).

Для количественной оценки неочищенной ДНК можно использовать цветную пробу с дифениламином, детально описанную в разд. 22.4.3.

Концентрацию ДНК в препарате, предназначенном для опытов по трансформации, можно измерить также по радиоактивной метке, включив в ДНК меченый ти-мидин до определенного уровня. При этом нужно, чтобы донорный штамм имел мутацию thyA, при которой блокируется эндогенный синтез тимидинмонофосфата; желательно также наличие мутаций deoB или deoC, обусловливающих предотвращение распада дезоксири-бозо-1-фосфата. Процесс мечения ДНК включает следующие процедуры:

1. В подходящую минимальную среду, такую, как среда VB-E (разд. 14.4.6), добавляют казаминовые кислоты без витаминов (до 0,5%; разд. 14.4.8).

2. Туда же вносят 5,0 мкКи 14С-тимидина или 3Н-ти-мидина и столько немеченого тимидина, чтобы общая концентрация его составила 4,0 мкг/мл.

3. Добавляют в среду клетки thyA deoB из расчета 106 клетка/мл и инкубируют культуру столько времени, чтобы клетки успели пройти 7 или больше делений.

4. Выделяют ДНК5. Наносят две одинаковые пробы ДНК объемом 25 мкл на диски фильтровальной бумаги Whatman ЗММ, наколотые на булавки из нержавеющей стали. Не ранее чем через 1 мин опускают фильтры в стакан с 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) для осаждения ДНК при комнатной температуре. Последующую промывку фильтров проводят в перфорированной емкости, представляющей собой полиэтиленовую бутылку с отрезанным горлышком, имеющую множество отверстий по бокам и на дне (отверстия можно сделать горячим трехгранным напильником).

6. Дважды промывают фильтры в 5%-ной ТХУ и два или три раза в этаноле, последовательно перенося перфорированную бутылку в стакан с соответствующим раствором.

7. Для высушивания бутылку с фильтрами помещают в сушильный шкаф, а затем измеряют радиоактивность каждого фильтра в сцинтилляционном счетчике (разд. 16.4.3).

8. В каждой пробе вычитают фон и подсчитывают число распадов в минуту, приходящееся на 1 мл препарата ДНК; для этого нужно знать эффективность счетчика для используемой сцинтилляционной жидкости (разд. 16.4.3).

9. Вычисляют концентрацию ДНК (в мкг/мл), зная удельную активность (в мкКи/мкг) суммарного меченого тимидина, добавленного в культуру, мол. % тимиди-на в ДНК, число распадов в 1 мин на 1 мл препарата ДНК и константу распадов в минуту для 1мкКи (2,2-106).

14.1.3. Трансформация

у Acinefobacter calcoaceticus

A. calcoaceticus — грамотрицательный оксидазоотри-цательный неподвижный кокк, компетентность которого развивается под действием различных условий культивирования, а трансформация не зависит от присутствия двухвалентных катионов [23]. Трансформацию этой бактерии легко осуществить в лабораторных условиях. Савула и Кроуфорд [34] показали, что гены trpA и trpB, кодирующие две субъединицы триптофансинтазы, тесно сцеплены и трансформируются совместно; они разработали метод отбора одинарных и двойных трансформантов на первичной селективной среде. Метод основан на том, что штаммы с мутацией trpA, образующие большие колонии на агаровой среде с 10 мкг/мл L-триптофана или 40 мкг/мл индола, дают маленькие колонии на среде, содержащей всего 5 мкг индола в 1 мл. Таким образом, трансформация реципиента с мутацией trpB, растущего только в присутствии 10 мкг/мл L-триптофана, с помощью ДНК донора с мутацией trpA приводит к появлению клеток, которые при посеве на агаровую среду с 5 мкг/мл индола образуют и маленькие, и большие колонии. Маленькие колонии возникают вследствие совместной