Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

как до, так и после лиофилизации. Кроме того, следует проводить периодические проверки, подтверждающие жизнеспособность хранящихся лиофилизованных культур. Их желательно также проверять на случай появления каких-либо изменений в свойствах бактерий в результате их замораживания — высушивания или длительного хранения.

12.2.2. Ультразамораживание

Некоторые виды бактерий, не поддающихся лиофилизации, удается длительно сохранять в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (—196°С) или в его парах (—150 X) в хорошо изолированных резервуарах. В Американской коллекции типовых культур успешно хранится таким способом множество «привередливых» бактерий, которые не утратили при этом свои фенотипические свойства в течение >15 лет.

Бактериальные культуры длительно сохраняются также в морозильниках с очень низкими температурами (например, в морозильнике типа Revco, Inc. при —70 °С). Такой метод хранения вполне пригоден для многих бактерий. Однако при этом необходимо помнить, что иногда выключается электропитание сети или выходит из строя компрессор. В таких случаях потерю ценных коллекций помогают предотвратить сигналы предупреждения, а также запасные морозильники или электрические генераторы. Имеющиеся в настоящее время в продаже морозильники (например, Revco, Inc.) обычно оборудованы аварийной сигнальной системой, работающей на аккумуляторе.

Рекомендуется также использование дополнительных систем предупреждения, таких, как звуковой, чувствительный к отключению напряжения датчик температуры (Arthur Н. Thomas Co., № 4052-W20), работающий в интервале от — 75 °С до 200 °С (±0,3°С). Он работает от аккумулятора и может быть укреплен на стенке.

Хранение в жидком азоте

Считается, что использование жидкого азота для длительного хранения микроорганизмов обходится очень дорого. Однако данные последних лет об успешном хранении в жидком азоте физиологически разнородных бактерий свидетельствуют о том, что его использование рентабельно несмотря на высокую стоимость. Цена жидкого азота колеблется от 20 до 50 центов за 1 л.

Имеется много холодильников, работающих на жидком азоте, различной конструкции и емкости, например типа MVE, Cryogenics, Linde, Union Carbide Corp. Их емкость варьирует от 10 до 1000 л, в них можно хранить от 300 до 40 000 ампул.

Ампулы

Выпускаются различные виды ампул для хранения бактерий в жидком азоте. Особенно широко используются следующие типы: боросиликатные с толстыми стенками (Wheaton Scientific, Cryule № 12483 и 12523 с готовыми насечками) и специальные широкогорлые ампу* лы (Wheaton, Gold Band Cell and Tissue Cryule № 12742). Эти ампулы емкостью 1,2 мл имеют вдавления, облегчающие их вскрытие. Вместо стеклянных ампул можно использовать предварительно простерилизованные полипропиленовые пробирки (38X12,5 мм) с завинчивающимися крышками и силиконовыми прокладками (Vangard International).

Криопротекторы

При хранении бактерий в жидком азоте применяют криопротекторы двух типов. К первому относятся глицерин и диметилсульфоксид (ДМС), которые легко проходят через клеточную мембрану и обеспечивают как внутриклеточную, так и внеклеточную защиту от замораживания. Ко второму виду криопротекторов относятся такие вещества, как сахароза, лактоза, глюкоза, маннит, сорбит, декстран, поливинилпирролидон и полигликоль, которые обеспечивают защитное действие на наружной поверхности клеточной мембраны. Протекторы первого типа, т. е. глицерин и ДМС, оказались более эффективными и пригодными для широкого круга бактерий. Выбор криопротектора зависит от вида бактерий. При замораживании новых штаммов следует предварительно проверить действие на них криопротектора.

Глицерин и ДМС обычно добавляют в ростовую среду в концентрации 10 и 5% (объем/объем) соответственно. Глицерин стерилизуют автоклавированием 15 мин при 104 Па.

Стерилизацию ДМС осуществляют фильтрованием, используя пористые свечи Села с размером пор 03„ ДМС собирают порциями по 10—15 мл в стерильные пробирки и хранят в замороженном состоянии при 5 °С (ДМС замерзает при 18 °С). Из-за накопления продуктов окислительного распада ДМС в открытых бутылях хранят не более 1 мес.

Подготовка культуры

В выживании бактерий после замораживания жидким азотом важную роль играет физиологическое состояние культуры. В основном в замороженном состоянии хранят активно растущие клетки из культур в середине или в конце экспоненциальной фазы роста [23].

Клетки выращивают в соответствующей среде. В случае жидких культур клетки отделяют в стерильных условиях центрифугированием и ресуспендируют осадок в стерильной свежей среде, содержащей или 10% (объем/ объем) глицерина (готовят добавлением 20%-ного глицерина к равному объему стерильной среды), или 5% (объем/объем) ДМС (приготовленного добавлением соответствующего количества 100%-ного ДМС к стерильной среде). В случае роста культур на агаре клетки смывают с его поверхности стерильной жидкой средой, содержащей подходящий криопротектор, и разливают в стерильные маркированные ампулы по 0,4 мл суспензии, содержащей не менее 108 клеток/мл.

Если штамм является патогенным, ватную пробку срезают на уровне верхнего конца ампулы и хранят ампулы в парах жидкого азота незапаянными. Это делают во избежание несчастных случаев в процессе их запаивания или во избежание взрывов в процессе оттаивания (из-за попадания в ампулу жидкого азота через мелкие отверстия и последующего быстрого выхода газа при комнатной температуре).

В случае непатогенных бактерий ампулу перед запаиванием охлаждают при 4°С не менее 30 мин. Затем

(2 ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

ее нагревают над местом круговой насечки (надрезом) стекла, вращая в пламени в течение нескольких секунд, чтобы удалить влагу. Эта процедура позволяет избежать увеличения давления внутри ампулы, которое может привести к появлению пузырей в процессе ее запаивания. Перед запаиванием из ампулы извлекают часть ватной пробки. Желательно запаивать ампулы с помощью оборудованного кислородно-газовой горелкой полуавтоматического устройства (например, Kohlenberg-Globe Equipment Co.), предназначенного для вытягивания и запаивания стекла. Считается, что в этом случае гарантируется минимум мелких капиллярных пор.

Осторожно пинцетом горячую ампулу ставят в штатив, погруженный в баню с холодной водой, с таким расчетом, чтобы она была погружена на глубину 0,6 см. Нельзя допускать попадания воды на горячую часть ампулы, иначе стекло может треснуть. После охлаждения ампулы готовы к замораживанию. Если все операции были выполнены удовлетворительно, температура содержимого в ампулах не должна подниматься выше 25 °С. В отсутствие автоматического устройства ампулы запаивают вручную на газовой горелке, но их необходимо при этом проверять на герметичность. С этой целью ампулы после запаивания оставляют на 30 мин при 5°С в 0,05°/о-ном растворе метиленового синего. Плохо запаянные ампулы обнаруживают по проникновению в них краски.

Замораживание

Опубликовано много работ о влиянии скорости охлаждения в процессе замораживания на выживание бактерий [4, 15]. Наилучшие результаты по выживанию и восстановлению бактериальных культур были получены в случае медленного охлаждения клеток, например со скоростью 1° С/мин.

Медленного охлаждения достигают следующим образом:

1. Ампулы с культурой помещают в алюминиевые

банки (Nasco № А545), которые вставляют в картонные

коробки (Murray and Heister, Inc.) с прямоугольными

отверстиями 6,4X27,9 см.

2. Коробки ставят в морозильную камеру автоматиЧАСТЬ И. РОСТ

ческого низкотемпературного холодильника (Union Carbide Corp., Linde BF3-2) и устанавливают определенную скорость охлаждения.

3. Замораживают клетки при контролируемой скорости охлаждения 1 °С/мин до —30°С, а затем при значительно большей скорости (15—30°С/мин) до —150 °С.

4. После достижения этой температуры ампулы переносят в сосуд с жидким азотом и хранят в нем при —196 °С или в парах азота (—150 °С),

Если нет автоматического холодильника с программой, медленное охлаждение может быть достигнуто с помощью одного из следующих приемов:

1. Стеклянные или пластмассовые ампулы с культурой в лотке из нержавеющей стали помещают на дно морозильника Revco на 1 ч при температуре —60 °С, а затем погружают их на 5 мин в баню с жидким азотом. Скорость охлаждения до —60 °С при этом составляет приблизительно 1,5°С/мин.

2. Рекомендуется также погружать поставленные в банки запаянные ампулы в градуированный цилиндр с 95%-ным этиловым спиртом [6]. Цилиндр с ампулами помещают в морозильник Revco при —85 °С, чтобы содержимое ампул охладилось до этой температуры, а затем банки с ампулами помещают в жидкий азот.

Оттаивание

Обнаружено, что быстрое нагревание замороженных микроорганизмов или спор приводит к их быстрому восстановлению (оживлению) [9, 14, 16, 17]. Подобные испытания были проведены с замороженными клетками бактерий из Американской коллекции типовых культур.

Чтобы оживить замороженные культуры, их быстро оттаивают в водяной бане при 37 °С и слабом встряхивании, пока не растает весь лед. В случае стеклянных ампул для этого обычно требуется 40—60 с, а в случае полипропиленовых — 60—120 с. Сразу же после оттаивания ампулу извлекают из водяной бани и дезинфицируют ее 70%-ным этанолом. Ампулу вскрывают и в стерильных условиях переносят культуру в свежую среду. Предостережение: при извлечении замороженных стеклянных ампул из жидкого азота не исключена возможность взрыва, поэтому во время этой процедуры следует надевать перчатки и защищать экраном лицо.

Для определения эффективности метода хранения в случае каждого штамма проверяют жизнеспособность культуры. Предполагаемое время выживания разных бактерий приведено в табл. 12.1.

12.3. ФИРМЫ-ИЗГОТОВИТЕЛИ

1. American Hospital Supply Corp., 1450 Waukegan Rd., McGaw Park, 1L 60085

2. Bellco Glass, Inc., 340 Edrudo Rd., P. O. Box «B», Vineland, N. J. 08360

3. Consolidated Vacuum Corp., 1775 Mt. Read Blvd., Rochester, NY 14603

4. Difco Laboratories, P. O. Box 1058A, Detroit, MI 48232

5. Fisher Scientific Co., 711 Forbes Ave., Pittsburgh

страница 96
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.09.2017)