Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

ужным диаметром 8 мм. Внутренние сосуды двойных ампул и одинарные ампулы в гребенке слегка прикрывают гигроскопической ватой и стерилизуют в течение 2 ч в сушильном шкафу при 170°С. Иногда вата содержит остатки масел и солей, которые, высвобождаясь в процессе нагревания, оставляют слабый налет на внутренних стенках ампул, токсичный для некоторых видов бактерий. Можно также стерилизовать ампулы автоклавированием в течение 1 ч; при этом их кладут на бок, чтобы внутрь легче проникал пар.

Ампулы метят несмывающимися чернилами. Для этой цели рекомендуется пользоваться маркирующим прибором (Markem Machine Co., тип 135А) и специальными чернилами (Markem Machine Co., № 7224). Эти чернила выдерживают сверхнизкие температуры и кратковременное воздействие такого растворителя, как спирт. После маркировки ампулы нагревают в течение 20 мин в сушильном шкафу при 160°С для закрепления чернил.

Подготовка культуры

Успех лиофилизации зависит от качества используемых клеток, от того, насколько они жизнеспособны и в каких условиях они выросли. Выращивают достаточно большое количеетво клеток так, чтобы в суспензии содержалось не менее 108 клеток/мл. Клетки собирают в период максимальной стабильности и жизнеспособности культуры, т. е. в поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазах роста.

Криопротекторы

Для подготовки клеток к лиофилизации их суспендируют в среде, содержащей криопротекторы. Американская Коллекция типовых культур достигла успеха в длительном хранении физиологически различных бактерий, применяя в качестве криопротекторов либо 20%-ное снятое молоко (при использовании двойных ампул), либо 24%-ный раствор сахарозы, разведенный равным объемом ростовой среды (конечная концентрация сахарозы 12% при использовании одинарных ампул). В других лабораториях в качестве криопротекторов используют декстран (10%), лошадиную сыворотку, инозит и др. [8, 14, 20].

В случае использования двойных ампул применяют следующую процедуру. Готовят 20%-ное снятое молоко (Difco 0032) и стерилизуют его порциями (по 5 мл) в течение 20 мин при 116°С. Следует избегать перегрева, так как при этом может произойти карамели-зация молока. В стерильных условиях собирают клетки, выросшие на поверхности агара, смывая их 20%-ным снятым молоком. Клетки, выращенные в жидкой культуре, отделяют в стерильных условиях центрифугированием и затем суспендируют осадок в стерильном молоке, так чтобы получилась суспензия, содержащая по меньшей мере 106 клеток/мл. Эту же процедуру применяют и в том случае, когда в качестве криопротек-тора используется сахароза.

В каждую двойную ампулу наливают 0,2 мл суспензии клеток, закрывают их ватными пробками и подравнивают пробки ножницами. После приготовления суспензии ее следует разливать по ампулам как можно быстрее. Интервал между разливом и процессом лиофилизации должен быть сведен до минимума, чтобы избежать изменений в культуре.

При использовании одинарных ампул в каждую из них наливают 0,1 мл суспензии бактерий. Вставляют ватные пробки на глубину приблизительно 1,3 см ниже края ампулы и обжигают их верхнюю часть, чтобы убрать лишние волокна ваты.

Лиофилизация с использованием двойных ампул

На рис. 12.1 показана типичная система для лиофи лизации, в которой используются двойные ампулы. Все вакуумные шланги сделаны из тайгона и имеют внутренний диаметр 0,9 см и толщину стенки 2,2 см. Система оснащена термисторным вакуумным измерительным прибором (Consolidated Uacuum Corp., модель GT-340A), с помощью которого можно измерять давление ниже 3-10-2 мм рт. ст. Когда прибор, измеряющий вакуум, помещают между конденсором и вакуумным насосом, давление должно оставаться постоянным. Если же его установить между камерой с ампулами и конденсором, то он будет регистрировать изменения давления пара в системе, и в частности подъем давления в момент начала высушивания. Однако после завершения процесса высушивания давление должно вновь опуститься ниже 3* Ю-2 мм рт. ст.

Внутренние ампулы с клетками помещают в вертикальном положении в сосуд из нержавеющей стали. Для лучшего высушивания используют только один ряд ампул. Чтобы заморозить клетки, сосуд с ампулами помещают на 1 ч в морозильник с температурой от ?—60 до —65 °С.

Ловушкой для паров воды служит конденсор (The Virtis Co., Inc.), куда кладут кусок сухого льда и наливают этилцеллосольв (Fisher Scientific Co., Е-180). Кран между вакуумной крышкой Atmo-vac (Refrigeration for Science, Inc.) и конденсором закрывают и из системы откачивают воздух до тех пор, пока давление не опустится ниже 3- Ю-2 мм рт. ст.

Через 1 ч сосуд из нержавеющей стали с ампулами помещают в большой неглубокий сосуд с колотым льдом, так чтобы лед окружал внутренний сосуд со всех сторон. В таком положении сосуды оставляют на 2— 3 ч. Необходимо следить, чтобы сухой лед не попал в сосуд с ампулами. Внутренний сосуд накрывают вакуумной крышкой, которую до момента открывания крана придерживают рукой. Кран проверяют на отсутствие утечки. Высушивание проводят в вакууме 2—3-10~2 мм рт. ст. в течение 18 ч. Для удобства сушку можно начать во второй половине дня и завершить утром.

Наружные ампулы с силикагелем извлекают из сушильного шкафа, помещают в сухой бокс с относительной влажностью <10% и дают им охладиться. Закрывают кран между вакуумной крышкой и конденсором. Выходное отверстие в верхней части крышки присоединяют резиновой трубкой к колонке с силикагелем, помещенной внутри сухого бокса. Открывают вентиль выходного отверстия, чтобы сухой воздух из колонки с силикагелем вошел в сосуд с ампулами. Ампулы переносят в сухой бокс и помещают каждую из них в наружную, сделанную из мягкого стекла. На ватную пробку во внутренней ампуле кладут кусочек бумаги (0,6 см) из стекловолокна (Whatman, Inc.) (линии на рис. 12.3 соответствуют изгибам стекловолокна, а не его слоям).

Двойные ампулы извлекают из сухого бокса и нагревают наружную ампулу на газовой горелке в том месте, где вставлена бумага из стекловолокна. Ампулу вращают над горелкой до тех пор, пока стекло не начнет размягчаться. Его медленно вытягивают пинцетом до того момента, когда сужение в ампуле превращается в узкий капилляр.

После охлаждения ампулы подсоединяют к вакуумному насосу с помощью резиновых пробок с отверстием, подходящим по размеру к открытому концу ампулы.

Воздух откачивают до тех пор, пока давление не снижается до 5-Ю-2 мм рт. ст., и затем запаивают капиллярное сужение в пламени газовой горелки.

Лиофилизация с использованием одинарных ампул

Используя специальное натягивающее устройство, заполненные ампулы вставляют в гребенку (рис. 12.2) с помощью стерильных трубок из латекса янтарного цвета длиной 2,5 см (American Hospital Supply Corp., № 17610-063; 0,47X0,16 см). Когда используют ампулы типа «Edwards», суспензию клеток замораживают, погружая ампулы в баню с этилцеллосольвом. Ампулы вращают в бане до образования ледяной корки, а затем закрепляют их в гребенке.

Ловушку для паров воды готовят так же, как описано в случае лиофилизации с использованием двойных ампул. Ампулы, помещенные в гребенку, остаются в бане из сухого льда с целлосольвом в течение всего процесса высушивания. Лиофилизацию проводят 18 ч в вакууме <3-10~2 мм рт. ст. Во время процесса лиофилизации температура бани постепенно повышается; ее снижают, добавляя в наружный сосуд куски сухого льда.

По окончании высушивания ампулы запаивают ниже ватной пробки в пламени газовой горелки и дают им остыть.

Хранение

Культуры, лиофилизованные как в двойных, так и в одинарных ампулах, хранят при температуре ниже 5°С. Если культуры находятся в холодильнике типа Revco при —30 или — 69 °С, они сохраняются еще лучше. При комнатной температуре лиофилизованные культуры хранить нельзя.

Восстановление культур из лиофилизованных клеток

Сильно нагревают запаянный конец наружной ампулы на бунзеновской горелке и быстро капают на него 1—2 капли воды, чтобы горячее стекло треснуло. Осторожно, но быстро пинцетом надламывают и удаляют верхушку, а затем вытаскивают пробку из стекловолокна и вынимают внутреннюю ампулу. Из последней аккуратно удаляют ватную пробку, стараясь не допустить загрязнения культуры попадающими извне волокнами.

Прежде чем открыть одинарные ампулы, их надрезают трехгранной пилочкой на расстоянии около 2,5 см от верхнего конца, а затем дезинфицируют, протирая кусочком марли, пропитанной 70%-ным спиртом. Обертывают ампулу стерильной марлей и обламывают надпиленный конец. Обычно это делают в вытяжном шкафу, а в случае патогенных бактерий — в специальном закрытом боксе. Перед тем как внести в ампулу жидкую среду, обломанный конец слегка обжигают. Некоторые исследователи используют вольфрамовую иглу, нагретую в кислородно-газовой горелке до белого каления. Такой иглой им удается сделать в верхней части ампулы маленькое отверстие. Это обеспечивает более медленное проникновение воздуха в ампулу и стерильность пространства вокруг отверстия. Жидкую среду вносят в ампулу стерильным шприцем с иглой и извлекают суспензию бактерий им же.

Лиофилизованную культуру переводят в суспензию сразу после вскрытия ампул, добавляя в каждую 0,3— 0,4 мл соответствующей стерильной жидкой среды. Суспензию в ампулах хорошо перемешивают и переносят в пробирки с 5 мл жидкой среды. После тщательного перемешивания отбирают 0,2 мл суспензии и наносят на твердую или полужидкую среду того же состава. Необходимо проверять чистоту культуры до лиофилизации и после нее. Для этого суспензию клеток стерильно разводят и делают посев штрихом на твердые среды. Пробирки и чашки со средой инкубируют при оптимальной для бактерий температуре и, как только начинается их рост, делают пересев на свежую среду, чтобы убедиться в чистоте культуры. Рост бактерий, подвергавшихся лиофилизации, часто начинается после длительной лаг-фазы. Поэтому нельзя делать заключение о гибели культуры, если инкубация была недостаточно длительной.

Проверка жизнеспособности бактерий

Чтобы определить, насколько эффективен процесс высушивания бактерий в замороженном состоянии, проверяют их жизнеспособность

страница 95
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.05.2017)