Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

при комнатной температуре в штативе или в специально сконструированном для хранения боксе, в котором имеются полки с отверстиями для пробирок. При таком хранении культур необходим постоянный контроль, поскольку они имеют тенденцию быстро высыхать, и если условия в лаборатории не регулируются, то культуры плохо переносят температурные колебания.

Для уменьшения высыхания культур используют завинчивающиеся крышки с резиновыми прокладками, обертывают верхнюю часть пробирок парафильмом (VWR Scientific, Inc.; № 52858-000) или помещают пробирки в пластмассовый мешок (VWR Scientific, Inc.; № 11215-790). Чтобы уменьшить скорости метаболизма микроорганизмов, культуры хранят в холодильнике при 5—8°С. Используя эти меры предосторожности, можно сохранять большинство бактерий в течение 3—5 мес без пересева.

Режим пересевов

Частоту пересевов (субкультивирования) определяют экспериментальным путем. Субкультивирование следует проводить как можно реже во избежание селекции вариантов. На случай потери культуры желательно сохранять дубликаты пробирок с ней. После каждого пересева культуру проверяют на чистоту и периодически проводят сокращенную проверку для выявления каких-либо изменений в фенотипических свойствах бактерий. В пересеваемых культурах не следует выделять единичные колонии, поскольку при этом повышается вероятность селекции мутантов.

Основными недостатками метода периодического пересева являются: риск заражения, ошибки при обозначении штаммов или наклеивании неправильной этикетки, селекция вариантов или мутантов, возможная потеря культур и необходимость выделения специального места для их хранения.

12.1.2. Хранение под минеральным маслом

Многие виды бактерий успешно хранят месяцами или даже годами с помощью сравнительно простого и дешевого метода, а именно под слоем стерильного медицинского минерального масла (можно использовать вазелиновое масло с удельной плотностью 0,865—0,890). Однако из-за недостаточной стерильности минерального масла при использовании этого метода может происходить заражение культур.

Масло стерилизуют в сушильном шкафу при 170°С в течение 1—2 ч; автоклавирование для этой цели применять не рекомендуется [19].

Культуры выращивают на косяках, в столбиках агара или в жидкой среде соответствующего состава. После появления достаточно хорошего роста в пробирку в стерильных условиях наливают слой минерального масла высотой не менее 2 см (косяки агара должны быть покрыты полностью) для защиты от высыхания, а также для уменьшения метаболической активности и замедления роста культур [5, 11].

Покрытые маслом культуры хранят в вертикальном положении в холодильнике. Для проверки сохранности культур периодически определяют их жизнеспособность.

Культуру под маслом можно пересевать на свежую среду с помощью инокуляционной иглы, а полученную культуру можно снова покрывать стерильным маслом. При обжиге иглы следует позаботиться о том, чтобы брызги масла не попали на окружающие предметы и персонал. Первичную культуру хранят не менее нескольких недель на тот случай, если субкультура окажется загрязненной или бактерии в ней будут иметь измененные свойства.

Этому методу присущи такие же недостатки, как и обычному субкультивированию (разд. 12.1.1). Кроме того, следует помнить о возможном загрязнении масла.

12.1.3. Обычное замораживание

Хранение бактерий в морозильной камере холодильника или обычном морозильнике при температуре от 0° до —20°С приводит к различным последствиям в зависимости от вида бактерий. В принципе, такой способ хранения не рекомендуется из-за повреждения клеток в эвтектических смесях концентрированных растворов электролитов (например, в такой смеси NaCl имеет эвтектическую точку — 20 °С) [14, 17]. Вместе с тем некоторые бактерии при замораживании можно хранить от б мес до 2 лет.

12.1.4. Высушивание

Большинство культур гибнет при высыхании в лабораторных условиях. Однако некоторые культуры, особенно спорообразующих бактерий, можно сохранять годами, если высушивать их в соответствующей среде [3]

Почва

Спорообразующие бактерии можно успешно хранить годами в стерильной почве, высушенной на воздухе [10]. Почву стерилизуют автоклавированием по нескольку часов в течение двух дней. Инокулят из суспензии спор (по 1 мл) вносят в пробирки, содержащие стерильную почву, и оставляют при комнатной температуре до заметного высыхания. Затем пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками и хранят в холодильнике.

Бумага

Сравнительно простым и недорогим способом хранения бактерий является их высушивание на полосках или дисках стерильной фильтровальной бумаги. Этот метод идеален для обеспечения контроля за качеством культур. В общей пробирке или в пузырьке с закручивающейся крышкой можно хранить много дисков, содержащих одну и ту же культуру. При необходимости диск достают стерильным пинцетом и в стерильных условиях вносят его в соответствующую жидкую среду. Предсаа-вителей сем. Enterobacteriaceae, а также многие другие бактерии можно сохранять на бумаге в течение нескольких лет.

Техника этого метода заключается в следующем. Стерильную бумагу пропитывают суспензией бактерий, содержащей не менее 108 клеток/мл, и высушивают на воздухе или под вакуумом [2]. Баюерии лучше выживают при высушивании под вакуумом. Полоски или диски бумаги хранят в запечатанных пробирках в эксикаторах или между листами стерильной прозрачной пластмассы [7] Если эксикаторы поместить в холодильник, то срок жизни культуры удлиняется.

Желатина

Многие гетеротрофные бактерии можно хранить в высушенных каплях или дисках желатины [24]. Обычно в таком виде бактерии лучше сохраняются при температуре —20 °С, чем при +4°С или при комнатной температуре.

Желатиновые культуры готовят следующим образом. Культуры выращивают в соответствующих средах и клетки получают центрифугированием в стерильных условиях. Осадок клеток ресуспендируют в малом количестве жидкой среды, переносят в пробирку с 2—5 мл расплавленной пищевой желатины и инкубируют при 30 °С до достижения плотности 108—1010 клеток/мл. Затем с помощью стерильной пастеровской пипетки или шприца вводят каплю бактериальной суспензии на дно стерильной пластмассовой чашки Петри. Чашку Петри помещают в эксикатор, содержащий пятиокись фосфора, и откачивают из него воздух вакуумным насосом. После того как капли желатины высохнут, их переносят с соблюдением правил асептики в стерильные пробирки с завинчивающимися крышками и хранят в холодильнике. Культуру бактерий получают после переноса желатиновой капли в стерильных условиях в пробирки, содержащие соответствующие среды.

12.2 МЕТОДЫ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ

12.2.1. Высушивание из замороженного состояния

Высушивание из замороженного состояния, или лио-филизация, является одним из самых экономичных и эффективных методов длительного хранения бактерий и других микроорганизмов. При его использовании многие физиологически разнородные виды бактерий и бактериофаги удается сохранять в жизнеспособном состоянии 30 лет и более. Этим методом бактерии можно хранить небольшими порциями в ампулах. Сама процедура лио-филизации достаточно проста, однако ее теоретические аспекты довольно сложны, и для более детального обсуждения мы отсылаем читателя к нескольким превосходным обзорам [1, 21, 22].

Лиофилизация заключается в удалении воды из замороженных суспензий бактерий путем сублимации при низком давлении, т. е. при этом вода испаряется, минуя жидкую фазу. Высушенные клетки сохраняются довольно долго, если защитить их от действия кислорода, влаги и света. В любой момент клетки можно перевести в гидратированное исходное состояние.

Лиофилизацию проводят разными способами с помощью различных приборов. Простейший из них представляет собой эксикатор, который охлаждают, чтобы клеточная суспензия во время подключения к вакуумному насосу оставалась в нем замороженной. Детали других способов лиофилизации и соответствующего оборудования описаны Уикерхэмом и Андреасеном [26], а также Хейнесом и др. [12].

Наиболее широко используется лиофилизация с центрифугированием и предварительное замораживание. Детальное описание метода лиофилизации с центрифугированием можно найти в работах Маглитона [18] и Лапа-жа и др. [2].

Оборудование

Для лиофилизации существует как простое и недорогое оборудование, включающее систему эксикатора с вакуумным насосом, так и достаточно сложное, которое стоит тысячи долларов. Воспроизводимость и сохранность культур зависят от используемой системы. Однако часто очень хорошие результаты можно получить с помощью простой системы, состоящей из высоковакуумного насоса, конденсора и камеры, или распределительной гребенки (рис. 12.1 и 12.2).

Ампулы

Существуют ампулы самой разной формы и размеров; чаще других для лиофилизации используются два основных типа. Для клеток, лиофилизуемых в камере (рис. 12.1), рекомендуются двойные ампулы (рис. 12.3). Такими ампулами легче пользоваться, они менее подвержены загрязнению посторонними микроорганизмами и более надежны для хранения патогенных штаммов, чем

обычные одинарные ампулы [25], которые сушат и закрывают непосредственно перед установкой в гребенку (рис. 12.2).

Внутренний сосуд ампулы сделан из мягкого стекла (VWR Scientific № 27921-015; 11,5X35 мм). Подготовку ампул к работе проводят следующим образом. На дно наружного сосуда из мягкого стекла (VWR Scientific

№ 27921-015; 14,25X25 мм) помещают гранулы силика-геля (Fisher Scientific Co., № 42, 6—16 меш, сорт Tel-Tale). Туда же кладут маленький кусочек ваты, чтобы предохранить от разбивания внутренний сосуд. Перед работой наружные сосуды выдерживают при 100 °С в течение ночи. В результате нагревания сили-кагель окрашивается в темно-синий цвет. При закрывании и хранении ампул цвет силикагеля не должен меняться.

Для гребенки используются одинарные ампулы двух типов. При поверхностном замораживании культуры используют 1-милли-литровые шариковые ампулы в форме капли (фирма Kontes, наружный диаметр 8 мм). При высушивании осадка применяют 1-милли-литровые ампулы «Ed-wards» трубчатого типа (Bellco Glass, Inc.) с нар

страница 94
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.07.2017)