Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

о имеет смысл делать в том случае, если к.в. данной ошибки меньше половины ошибки по Пуассону. Предположим, что точность каждого отбора пробы пипеткой равна 1% вместо 2%. Тогда общая ошибка, обусловленная использованием пипетки, составляет уб -1 % = 2,23 %, а общий к.в.

соответственно равен У4,1 %2+2,23%2 = 4,7%, т. е. лишь немного больше, чем сама ошибка по Пуассону при подсчете.

Подобные рассуждения используют в тех случаях, когда производят вычитание фоновых величин и величин, характеризующих контрольные пробы, где применимо первое правило распространения ошибок, или после стандартизации прибора и метода, где применимо второе правило. При использовании контрольных измерений ошибки должны быть снижены благодаря многократным измерениям или благодаря более точному измерению по сравнению с опытными данными, так что они не вносят существенного вклада в общую ошибку.

11.5.4. Коэффициент точности

Существует очень мощный общий метод, пригодный для различных экспериментальных условий в диапазоне от крупных природных экосистем и до капли культуры на сетке, предназначенной для электронной микроскопии.

Метод применим к различным эталонным частицам— бактериям, частичкам ферритина, полистироловым шарикам, абортиьно трансдуцированным бактериям, плазмидам, вирусам и т. д. После перемешивания суспензии отбирают пробы и с помощью соответствующего метода определяют отношение числа изучаемых бактерий к числу эталонных частиц. Метод можно проиллюстрировать для случая микроскопических мазков, содержащих эталон (полистироловые бусы) и неизвестное количество клеток изучаемых микроорганизмов. Мазок готовят из известных объемов клеточной суспензии и взвеси бус известной концентрации. Из произведения концентрации бус на отношение количества клеток к количеству эталонных бус определяют концентрацию клеток. В этом случае применимо второе правило распространения ошибок. Если концентрация эталонных частиц в исходном основном растворе заведомо определена без ошибок, то к.в. неизвестных частиц можно определить по формуле

K.B.= /l/tf„+l/tf,e

где Nu и Nr— количество неизвестных и эталонных частиц соответственно.

Для минимизации общего числа подсчетов Nu в этой формуле должно _быть примерно равно Nr. Тогда к.в. будет примерно в У2=1,4 раза выше, чем в случае, когда подсчитывалось бы бесконечное число эталонных частиц (или неизвестных частиц).

П.5.5. Коррекция на совпадения

Коррекцию на совпадение необходимо проводить в ряде случаев, например при наличии очень большого числа колоний на чашке или клеток в квадрате счетной камеры, а также при высокой радиоактивности, регистрируемой счетчиком. Предположим, что при подсчете числа колоний две клетки, находящиеся ближе чем на расстоянии г, учитываются как одна. Пусть Nt — истинное количество колоний, Na— результаты счета, а ^ — радиус чашки Петри. Рассмотрим единственную клетку. Вероятность того, что другая клетка находится от нее на расстоянии не более г, равна Nmr2lnR2> или Ntr2IR2. Если зарегистрировано Na колоний, то потеря в счете составит NaNtr2IR2. Отсюда

Nt=Na+MJftr2/R2=Na(l+ cNt),

где c — r2/R2. При незначительной коррекции обычно удобно заменять в правой части формулы Nt на Na- Из этой формулы видно, почему 4-кратное снижение размеров колонии в 16 раз снижает коррекцию несовпадения при таком подсчете. Это является основой описанного выше метода посева в многослойный агар.

11.5.6. Расчеты экспоненциального роста

При постоянных условиях, когда межклеточное взаимодействие мало в течение достаточно длительного времени, ожидается, что рост, измеряемый любым методом, происходит в соответствии с формулой X=X0eKt. Ее можно переписать в любой из нижеследующих эквивалентных форм:

\nX=\nX0+Xt,

lg*=lgX0+W/2,303, или

В последней формуле Тч — время удвоения, которое можно рассчитать по формуле

7= (In 2)/Х=0,6931 /Я.

Кроме X для обозначения удельной скорости роста (или константы скорости роста) используют многие другие символы, в том числе а, ^ и р. Это необходимо знать, поскольку они встречаются в ряде статей без определения. Наибольшая путаница происходит с символом р, который в литературе используется как для обозначения удельной скорости роста (при проточном культивировании), так и для обозначения числа удвоений культуры в час (в литературе по физиологии клетки). В последнем случае в значение р, входит множитель 1п2 = 0,6931. Чтобы избежать путаницы, удельную скорость роста лучше обозначать символом К, так как его редко применяют для других целей в микробиологии. Для времени могут использоваться любые единицы, но обычно его выражают в часах. Время удвоения (72) выражают как в минутах, так и в часах,

11.5.7. Построение и аппроксимация кривой в случае экспоненциального роста

Существует несколько альтернативных способов аппроксимации данных в модели экспоненциального роста. Все они одинаково надежны, но отличаются между собой степенью точности и количеством извлекаемой из них информации.

Наиболее простой подход заключается в том, что строят график зависимости натуральных логарифмов концентрации клеток (или сухого веса биомассы, или другого измеряемого в процессе роста параметра бактерий) от времени и определяют наклон получаемой прямой. Если шкала времени выражена в часах, то наклон будет выражаться в час"1. Здесь возникают два вопроса. Насколько прямая линия соответствует имеющимся данным? Отражает ли полученная линия всю совокупность данных?

Можно использовать десятичные логарифмы с основанием 10; в этом случае наклон следует умножать на 2,303=1п10. При использовании логарифмов с основанием 2 (таблицы приведены в работе [5]) наклон умножают на 0,6931 —1п2; последний способ имеет свои преимущества, поскольку величина, обратная наклону, выраженному таким образом, представляет собой время удвоения. Независимо от того, какое используется основание логарифма, на шкалу следует наносить как характеристику, так и мантиссу.

Удобно пользоваться бумагой с полулогарифмической шкалой (Keuffel and Esser Co., № 46-4850). Ось абсцисс (ось X) размечают в часах или сутках на главных делениях, так чтобы на малые деления приходилось четное число минут или часов. На каждом третьем делении по оси ординат (ось Y) откладывают 10 в соответствующей степени. Единицы шкалы можно умножать на постоянную величину, но нельзя прибавлять или вычитать постоянную из значений логарифмической шкалы. На оси У отмечают точки, соответствующие количеству биомассы, количеству клеток или другому показателю, характеризующему рост. Для большей наглядности полезно обводить эти точки кружками. При использовании методов светорассеяния следует наносить точки на график сразу же после того, как сделаны измерения. Это часто помогает выяснить, когда были совершены ошибки и какие они — биологические, инструментальные или арифметические. Если ошибка сразу же обнаружена, еще есть возможность заново засеять культуру, или повторно провести измерение, или же снова нанести точку. После того как нанесены все данные, по точкам проводят прямую.

Математический метод, с помощью которого определяют минимальную сумму квадратов расстояний по вертикали от всех точек до прямой, называется способом наименьших квадратов. Аппроксимированную прямую можно провести визуально, мысленно отмерив расстояние от тех нескольких точек, которые дальше всего расположены от предполагаемой прямой линии. Построенная с помощью линейки, такая прямая может быть почти идентична прямой, рассчитанной с помощью способа наименьших квадратов.

На рис. 11.6 показана реальная кривая роста, построенная на глаз, которая совпадает с прямой, построенной с помощью компьютера. Этот пример взят из тщательно выполненного эксперимента с точными данными, полученными в период времени, за который произошло 30-кратное увеличение клеточной массы. Следует отметить, что полученные точки очень близки к прямой, что свидетельствует об отсутствии явной ошибки в процессе эксперимента. Этот пример был выбран с целью показать, что при высокой чувствительности измерений скорости роста получают точные данные.

Имеется много типов полулогарифмической бумаги, которые различаются числом порядков, умещающихся на оси У. Чем меньше число порядков, тем больше отдалены точки на этой оси и тем точнее можно построить график. Именно полулогарифмическую бумагу рекомен

дуется использовать при работе как с натуральными, так и с десятичными логарифмами, а также с логарифмами, которые имеют основание 2.

График используют для определения времени удвоения, которое является одним из самых важных параметров скорости роста (позднее при желании можно вычислить удельную скорость роста). Время удвоения легко найти, измерив время, за которое концентрация бактерий удваивается. Для этого на графике выбирают точку и снимают показания на оси абсцисс для двух других точек с ординатой вдвое большей или вдвое меньшей, чем ордината выбранной точки. Время удвоения находят, определив разность между значениями абсциссы этих точек и первой выбранной точки. Более точные результаты можно получить, определив время увеличения массы в 4,8 или 2N раз и затем разделив его на 2,3 или N, что дает время удвоения. После этого можно вычислить удельную скорость роста и другие его параметры.

11.5.8. Аппроксимация по способу наименьших квадратов

Поскольку метод наименьших квадратов является наиболее точным для аппроксимации данных, его следует широко использовать, тем более что стоимость микрокалькуляторов с программами вычисления линейной регрессии невысока. В табл. 11.3 представлены данные для рис. 11.6, обработанные на микрокалькуляторе Hewlett-Packard с использованием способа наименьших квадратов.

Можно использовать любой калькулятор с программами вычисления линейной регрессии, руководствуясь прилагаемыми к нему инструкциями.

Первым этапом является накопление сумм, сумм квадратов и сумм перекрестных произведений. Особое внимание следует обратить на вычисление натурального логарифма числа клеток и использовать его в качестве переменной У. Время соответствует переменной X. Перед процессом суммирования (2+) на

страница 91
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.05.2017)