Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

слоем агара осторожно опускают в чашку Петри, содержащую достаточное для покрывания агарового слоя количество фиксатора Боуэна.

Водоиасыщенная пикриновая кислота 75 мл

Формалин 25 м

Ледяная уксусная кислота 5 м

Эти компоненты смешивают и хранят в закупоренном пузырьке. Растворимость пикриновой кислоты—1,4 г/100 мл при 20 °С; в качестве исходного следует хранить водонасыщенный раствор и по мере надобности использовать его для приготовления фиксатора.

В одной чашке можно фиксировать несколько кусочков агара. Их оставляют на некоторое время в покое для полного проникновения фиксатора (минимум на 45 мин и максимум на 4 ч) и фиксации клеток на покровном стекле. Агар может отойти от стекла сам по себе или можно помочь ему отделиться, удерживая внизу покровное стекло пинцетом и приподнимая агар кончиком ножа резким движением; при этом следует избегать бокового смещения слоя вдоль стекла. Затем покровное стекло отмывают водой и кладут в 70%-ный этанол, где оно лежит до момента окрашивания.

Фиксированные по Боуэну препараты лучше всего окрашиваются разведенными растворами основных красителей. Подходят для этого 0,01%-ные растворы кристаллического фиолетового, тионина или метиленового синего, которыми прокрашивают в течение 1—5 мин. Точное время окрашивания определяют в предварительных экспериментах. Для окрашивания цитоплазматиче-ских включений могут применяться другие красители (разд. 3.3.11). Основные красители прокрашивают богатую рибосомами цитоплазму преимущественно в хорошо сохранившихся, фиксированных по Боуэну клетках; нуклеоплазма не окрашивается, она негативно выявляется точно так же, как и при фазово-контрастной микроскопии живых клеток. Описанный способ фиксации не годится для окраски нуклеоллазмы по Гимзе, даже после обработки рибонуклеазой или кислотного гидролиза.

Клеточные стенки не прокрашиваются (наиболее убедительно это продемонстрировано на образующих нити представителях рода Bacillus), но их можно эффективно выявить обработкой фиксированных по Боуэну клеток 5%-ной (вес/объем, в воде) дубильной кислотой в течение 20 мин с последующей промывкой и окраской 0,01%-ным кристаллическим фиолетовым, достаточной по времени для интенсивного прокрашивания стенок. Предварительная обработка насыщенным раствором хлористой ртути в течение 5 мин также позволяет окрасить клеточную стенку основными красителями, такими, как кристаллический фиолетовый, тионин, виктория синяя [10]. Однако абсолютно надежного метода нет, причем наибольшие трудности возникают с грамотрицатель-ными бактериями.

Заключают препарат в воду или разбавленный краситель (последний полезен, если интенсивность окрашивания недостаточна для фотографирования), аккуратно промокают его, чтобы удалить избыток воды сверху и по краям покровного стекла, и заливают по краю покровного стекла воск, васпар или лак для ногтей. Из препарата можно удалить воду и сделать его постоянным, применив заливку смолой, но результат при этом не всегда удовлетворяет исследователя. Лучший способ сделать препарат вечным — сфотографировать его, а для этого описанный прием идеален.

4-1260

49

Некоторые клетки не пристают хорошо к стеклу после фиксации через слой агара или применения метода пленочного прилипания (см. ниже). Эту трудность можно частично преодолеть, если предварительно покрыть поверхность покровного стекла тонкой пленкой сывороточного или яичного альбумина и дать ей высохнуть. Образующаяся пленка может дать в готовом препарате слабоокрашенный фон, но в целом результат получается очень неплохой. Положительно заряженная пленка из полилизина может оказаться еще более эффективной, чем две вышеупомянутые [4].

2.2.2. Фиксация парами

Клетки, распределенные по поверхности агаровых слоев, независимо от того, были они там выращены или перенесены из другой среды, удобно фиксировать для световой микроскопии парами четырехокиси осмия или альдегидов, таких, как формальдегид или глутаральде-гид. Правда, при этом способе не подавляются все ферменты, и поэтому он не всегда годится для фиксации в цитохимических исследованиях. Ниже мы подробно опишем метод фиксации Os04, поскольку это один из самых распространенных и полезных методов. Для него характерны следующие этапы.

1. Приготавливают 1%-ный или 2%-ный раствор четырехокиси осмия (вес/объем) в дистиллированной воде. Кристаллический реактив 0s04 определенного веса

поставляется в запаянной ампуле. Ампулу разбивают и

вносят ее содержимое в соответствующий объем воды.

Кристаллы растворяются медленно, поэтому приготовление нужно начинать за 1 или 2 дня до использования.

Предупреждение. Os04— раздражающий агент, его пары опасны для глаз и слизистых оболочек, поэтому с ним необходимо работать под тягой. Хранят реактив в холодном темном месте и желательно в темных склянках, чтобы предотвратить образование черного неактивного продукта.

2. Кусочки агара на предметном стекле с клетками

наверху помещают в закрытую кювету с несколькими

миллилитрами раствора Os04. В качестве опоры для

стекол используют стеклянные шарики, лежащие па дне

2. ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ

кюветы. Благодаря этому предметные стекла с агаром находятся над раствором фиксатора.

3. В течение 1,5—2 мин парам дают возможность адсорбироваться.

4. Предметные стекла вынимают и накрывают слой агара покровным стеклом. Покровное стекло захватывают специально предназначенным для этого пинцетом и быстрым резким движением поднимают его вверх, отделяя от агара. Иногда поступают иначе: переворачивают кусочек агара на покровное стекло и резко сбрасывают его кончиком ножа, так чтобы некоторые клетки остались на стекле.

5. Немедленно опускают покровное стекло в колумбийскую кювету с 70%-ным этанолом, где его можно держать, пока все не будет готово для последующей окраски.

Методы окрашивания могут быть теми же, что и для препаратов, фиксированных по Боуэну. Как и в том случае, цитоплазма окрашивается основными красителями, такими, как тионин, а нуклеоплазма не окрашивается. Однако нуклеоплазма имеет вид более узких пятен, чем при фазово-контрастной микроскопии живых клеток. Фиксированные Os04 препараты пригодны для окрашивания нуклеоплазмы по Гимзе либо после гидролиза ри-бонуклеазой (100 мкг/мл в 1 мМ MgS04 в течение 30 мин), либо после гидролиза кислотой. Последний метод состоит из следующих стадий.

1. Покровное стекло с фиксированными клетками

помещают на 6—8 мин в 1 н. НС1 при 60 °С.

2. Отмывают его в воде.

3. Окрашивают раствором Гимзы (10 капель краски на 10 мл 0,067 М фосфатного буфера, рН 6,6) в течение 10 мин (или более) в случае почти всех грамотрицатель-ных бактерий.

4. Промывают буфером и смотрят в микроскоп, проверяя, нормальная ли получилась окраска. (На этом этапе хорошо помогает водоиммерсионный объектив, но он не обязателен.)

5. Заключают препарат в воду или разведенный краситель. Последний вариант хорош для грамотрицатель-ных бактерий, поскольку их цитоплазма может быть еле видна.

4*

51

Нуклеоплазма окрашивается в сине-фиолетовый цвет, а цитоплазма — в розоватый. Первая стадия этого метода, безусловно, представляет собой основу для окраски по Фёльгену, и нуклеоплазма, содержащая ДНК, после гидролиза окрашивается в красный цвет реактивом Шиффа [8].

Пленочные препараты, фиксированные таким способом, могут быть очень полезны при изучении изменений в клетках, подвергшихся множественной обработке в агаре или в жидкой культуре, например, во время фаговой инфекции [5]. Следует обратить внимание на то, что во время фиксации нуклеоплазма реагирует на наличие в среде катионов, избыток которых приводит к конденсации хроматина [6].

2.3. ЛИТЕРАТУРА

1. Barer R., Ross R. F. A., Tkczk S. Refractometry of living cells. Nature (London), 171, 720—724 (1953).

Основные положения, касающиеся показателя преломления в средах при фазово-контрастной микроскопии.

2. Girbardt М. Eine Zieischnittmethode fur Pilzzellen. Microscopic, 20,

254—264 (1965).

Полезные советы по пленочному прилипанию культур на предметных стеклах.

3. Mason D. J., PowelsQn D. M. Nuclear division as observed in live bacteria by a new technique. J. Bacterid, 71, 474—479 (1956). Описаны наблюдения последовательных этапов деления нуклео-идов бактерий, которые иллюстрируются фазово-контрастными микрофотографиями.

4. Mazia D., Schatten G., Sale W> Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. J. Cell Biol., 66, 198—200 (1975).

5. Murray R. G. E., Whitfield J. F. Cytological effects of infection with T5 and some related phages. J. Bacterid., 65, 715—726 (1953). Применение световой микроскопии в цитологии при изучении фаговых инфекций.

6. Murray R. G. E.t Whitfield У. F. The effects of the ionic environment on the chromatin structures of bacteria. Can. J. Microbiol., 2, 245—260 (1956).

Наблюдения, в которых уделено особое внямание действию катионов на нуклеоидную структуру.

7. Patton А. М., Marchant R. An ultrastructura] study of septal development in hyphac of Polyporus biennis. Arch. Microbiol., 118» 271 —

277 (1978).

Другой пример методики пленочного прилипания.

8. Piekarski G. Zytologische Untersuchungen an Bakterien mit Hilfe

der Feulgenschen Nuclealreaktion. Arch. Microbiol., 8, 428—439

(1937).

Применение реакции Фёльгеиа для четкого выявления очертаний бактериальных нуклеондов.

9. Robinow С. F. The preparation of yeasts for light microscopy. Methods Cell Biol., 11, 1—22 (1975).

Практическая рекомендация no применению желатино-агаровых культур на стеклах.

10. Robinow С. F., Murray R. G. Е. The differentiation of cell wall, cytoplasmic membrane and cytoplasm of gram-positive bacteria by selective staining. Exp. Cell Res., 4. 390—407 (1953). Выявление клеточных стенок методами окраски.

11. Schaechter M.t Williamson J. P., Hood J. R., Koch A. L. Growth, cell and nuclear divisions in some bacteria. J. Gen. Microbiol., 29, 421—434 (1962).

Описан способ увеличения показателя преломления среды для фа-зово-контрастной микроскопии.

Глава 3

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ

В СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Р. Дойч

Чт

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)