Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

лишь периодически. Для этого сначала строят калибровочную кривую, измеряя мутность известной суспензии на спектрофотометре, и затем используют приведенные выше формулы.

С одинаковыми по форме и размерам кюветами мутность, измеренная в широколучевом спектрофотометре, меньше, чем измеренная в узколучевом (т. е. широколучевой спектрофотометр характеризуется меньшей чувствительностью). Это осложняет работу, поскольку каждый раз при замене фотоумножителя или источника света возникает необходимость в новой калибровке. В некоторых приборах заметное изменение поглощения происходит даже при замене или удалении держателя для кювет. Поэтому рекомендуется частая настройка таких приборов по узколучевому спектрофотометру. Например, чувствительность спектрофотометра типа Beckman-DU резко изменяется после помещения в кюветное пространство термостатирующего устройства [30]. Это неудивительно, поскольку за счет такого устройства удлиняется рабочее расстояние, и тем самым этот спектрофотометр по своим параметрам (в том числе чувствительности) становится похож на аналогичный узколучевой прибор.

При работе со спектрофотометрами, в которых используются дифракционные решетки, необходим специальный контроль. Это связано с тем, что по мере старения реплик решетки спектр искажается, в результате чего на фотоумножитель попадает больше рассеянного света.

Колориметр типа Klett-Summerson

Это, пожалуй, один из лучших колориметров, отличающийся невысокой стоимостью, надежностью и стабильностью. Он используется многими исследователями вот уже более 40 лет. Стабильность прибора объясняется тем, что все колебания интенсивности его источника света компенсируются двухлучевой системой. Он имеет простой и не очень чувствительный детектор на CdS, который обеспечивает сигнал, достаточный для регистрации гальванометром. Детектор в этом колориметре отнесен далеко от кювет и поэтому улавливает меньше рассеянного света, чем в других аналогичных приборах.

Калибровка этого прибора отличается от калибровки современных приборов: поглощение в 1 ед. на других приборах соответствует поглощению в 500 ед. на шкале колориметра Klett-Summerson. Показания снимаются настолько медленно, что мутность суспензии палочковидных бактерий становится стабильной ко времени, когда заканчивают подводку шкалы. К этому времени клетки приобретают случайную ориентацию. Следует быть особенно внимательными при снятии показаний со шкалы прибора и подведении шкалы гальванометра к нулю. Чтобы избежать ошибки, связанной с параллаксом, необходимо найти постоянное положение. Основным недостатком этого прибора является отсутствие устройства для настройки темиового тока. При рассеянии на внутренних поверхностях прибора, при отражении от стеклянных стенок кюветы и т. п. свет может попасть на детектор, минуя содержимое кюветы. Чтобы учесть этот эффект, свойственный другим приборам без настройки темнового тока, кювету заполняют раствором с очень высоким поглощением (0% пропускания). Для колориметра типа Klett-Summerson должно иметь место зашкаливание прибора, т. е. стрелка должна находиться на уровне вертикальной линии, которая образует левую сторону буквы R в слове COPYRIGHT. Частые нарушения калибровки могут приводить к постоянной ошибке, вызывающей дополнительные отклонения от закона Ламберта — Бэра. В этом случае необходимы специальная настройка прибора, ремонт или замена источника света. Частично эту проблему можно разрешить путем повторного нанесения черной краски на внутренние поверхности прибора.

11.4.2. Нефелометрия

Хотя основная часть света рассеивается практически в прямом направлении, для измерения концентрации бактерий используются приборы, в которых светорассеяние измеряется под углом 90^ к падающему пучку света. Такие приборы называют нефелометрами. По этому же принципу концентрацию бактерий можно измерить в спектрофлуориметре, установив монохроматоры возбуждения и эмиссии на одну длину волны.

Очень высокая чувствительность нефелометров позволяет измерить крайне низкую концентрацию бактериальных суспензий. На практике основная трудность заключается в возникновении ложных сигналов за счет присутствия в среде примесей; ее можно частично преодолеть предварительной ультрафильтрацией среды. Вторая трудность заключается в необходимости постоянной калибровки прибора при серийных измерениях. В отличие от спектрофотометра для нефелометра или спект-рофлуориметра калибровка заключается в установке темнового тока таким образом, чтобы контрольная проба, содержащая только компоненты среды, давала на шкале нуль. Затем шкалу устанавливают на фиксированный ответ, вызываемый стандартным рассеивающим раствором, т. е. строят стандартную кривую. Поскольку бактериальная суспензия нестабильна, она не подходит в качестве стандарта; эту роль может играть пластинка опалового стекла или суспензия стеклянных бус, используемых для разрушения какого-либо биологического материала. Обычно при калибровке прибора используют запаянную пробирку, содержащую стандарт мутности. Затем строят стандартную кривую, отражающую зависимость между показаниями прибора и концентрацией бактерий в серии разведений. При высоких концентрациях бактерий такая кривая нелинейна.

Хотя существует очень много приборов для измерения рассеянного света и ими широко пользуются уже довольно давно, всем им присущ недостаток, который заключается в том, что от частиц, сравнимых по размерам с бактериями, значительная часть света рассеивается почти в прямом направлении (рис. 11.3). Чтобы зарегистрировать такой рассеянный свет, необходимо иметь возможность ориентировать детектор прибора таким образом, чтобы он улавливал световые пучки, отличающиеся по направлению от пучка падающего света лишь на несколько градусов. Важно также, чтобы детектор не испытывал помех со стороны неотклоняющегося света падающего пучка. Иными словами, необходим очень хорошо коллимированный пучок света. Этому требованию удовлетворяет лазерный луч или пучок света, расходящийся лишь на небольшой угол (2—12°), однако из-за очень высокой стоимости приборы, в которых их получают, пока практически недоступны. Измерения при больших углах, помимо информации о количестве клеточного материала, дают также информацию о внутренней структуре клеток и распределении внутриклеточного материала. Если известны факторы, влияющие на светорассеяние, а также тип ориентации в пространстве удлиненных частиц, то светорассеяние при определенных углах может дать информацию о состоянии агрегации цитоплазмы (например, полисомной или моносомной организации рибосом) [6], толщине клеточной оболочки [27, 29, 35, 54] и распределении клеточного содержимого от центра к периферии клетки [27, 54].

Уайт [54] разработал прибор для измерения угловой зависимости сигнала светорассеяния при температурах от 30 до 150°С. В этом интервале различные организмы, различные воздействия на культуру, а также культуры в различных стадиях развития характеризуются своими особенностями. Этот метод можно использовать для диагностики и для изучения действия лекарственных препаратов. Как уже упоминалось выше, светорассеяние при больших углах малопригодно для измерения роста бактерий, поскольку оно чувствительно к деталям структур клеток.

Светорассеяние в интервале углов 0—30° меньше зависит от этих трех факторов, но значительно более чувствительно к размеру частиц. С помощью светорассеяния в этом интервале на неповрежденных клетках можно получить информацию о концентрации биомассы, количестве клеток, среднем отношении длины клетки к ее ширине, а также о распределении биомассы вокруг центра бактериальной клетки.

11.5. СТАТИСТИКА И РАСЧЕТЫ

В руководствах по основам микробиологии или в курсе статистики, преподаваемом студентам-микробиологам, некоторые аспекты измерения бактериального роста почти никогда не рассматриваются. В первом случае это связано с перегруженностью основного материала руководств, а во втором — с тем, что подсчет колоний или частиц опирается на событие типа «все или ничего» и поэтому не представляет интереса для большинства лиц, применяющих статистику. Приводимый ниже материал преследует цель сделать используемые в бактериологии математические средства более доступными.

11.5.1. Распределение популяций

Биномиальное распределение описывает вероятности реализации двух противоположных событий. Например, оно позволяет ответить на вопрос: «Какова вероятность иметь 5 мальчиков в семье из 9 человек при условии, что доля рождения мальчиков составляет 0,56 от общего числа всех родившихся?». Численный ответ будет Р5 = 0,2600, а соответствующая формула имеет вид

где р— вероятность наступления благоприятного события при одном испытании, п — общее число испытаний, г—число благоприятных событий, которое может принимать значения от 0 до п. Эта формула показывает, что большинство семей с девятью детьми имеют 5 мальчиков, а не какое-либо другое количество, поскольку Р4=0,2044, Ръ= 0,2600 и Р6=0,2207. Кривая зависимости Рг от г представляет собой гистограмму распределения. Биномиальное распределение позволяет определить математическое ожидание и среднеквадратичное отклонение р по экспериментальным данным. Если допустить, что данные получены только для одной семьи с 9 детьми и что в этой семье есть случайно 5 мальчиков, то с помощью статистической теории можно показать, что лучшей оценкой величины р является отношение г/л. В нашем примере р = 5/э=0,5556, а среднеквадратичное отклонение для этой величины будет равно Ур(1—р)1п = = У(5/9)Х(4/9)/9-0,1656.

Этот результат не очень надежен, поскольку коэффициент вариаций (к.в.) близок к 30% (к.в. = 0,1656-100%/ /0,5556 = 29,81%). Точность оценки р можно увеличить, используя ту же формулу для семьи со значительно большим числом детей. Однако не только гораздо легче, но и лучше объединить статистические данные для ряда семей. Предположим, что для большого числа семей мальчики составляют 50 000 из 90 000 детей. Следовательно, по той же формуле р = 0,5556, но к.в. уже равен 0,2981%. Это более точный подсчет не только благодаря значительно большему числу семей

страница 89
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.09.2017)