Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

ия, сменяющееся значительно более медленным, которое может продолжаться очень долго. Соответственно после открывания шторки или удаления непрозрачного объекта в таких приборах пропускание вначале происходит очень быстро, а затем наблюдается медленный подъем светопропускания, которое никогда не достигает стабильной величины. Этот дрейф связан с тем, что фотоумножитель «помнит» условия предшествующего освещения. Двухлучевые фотометры с одним умножителем лишены этого недостатка, так как в них один и тот же детектор попеременно измеряет контрольную пробу и опытную. Ошибку при измерениях в однолучевом спектрофотометре можно свести к минимуму, если попеременно освещать контрольные и опытные пробы в течение строго определенного времени.

Существует и вторая причина установления строго определенного времени измерения мутности даже при работе с высококачественным фотометром. Это — зависимость колебаний мутности от способности палочковидных бактерий образовывать скопления. Чем длиннее палочки, тем более выраженной будет их агломерация в свежеперемешанных культурах. При работе с микроорганизмами типа Е. coli с небольшим отношением длины к диаметру их следует перемешать в кювете, поместить в спектрофотометр, выждать определенное время (например, 45 с) и затем снять показания. Долго выдерживать кювету не рекомендуется, поскольку она нагревается от источника света с образованием конвекционных потоков, вызывающих частичную вертикальную ориентацию палочковидных бактерий. Можно также проводить измерения мутности суспензий, содержащих палочковидные бактерии, в условиях небыстрого протока, где они ориентируются вдоль потока жидкости [22]. Возле стенок кюветы такая ориентация более выражена, чем в центре, из-за более значительного перепада скоростей потока у стенок. Безусловно, этот метод требует калибровки в адекватных условиях с использованием организмов, характеризующихся одинаковыми осевыми отношениями.

Калибровка

Чтобы иметь возможность сравнивать результаты различных исследователей, необходимо провести калибровку спектрофотометра применительно к данной культуре. По причинам, изложенным ниже, не следует реги стрировать показатели мутности в единицах поглощения при определенной длине волны. Вместе с тем, если проводят измерения клеток размером от 0,4 до 2 мкм3 на спектрофотометре с узким пучком и допускается пересчет полученных данных на сухой вес, то необходимо использовать факторы пересчета и учитывать отклонения от закона Ламберта — Бэра [30, 32].

Для калибровки готовят концентрированную суспензию микроорганизмов, выросших в соответствующих условиях, и делают серию разведений хорошо перемешанной суспензии. Измерения проводят максимально быстро, чтобы не возникало необходимости специально прекращать рост клеток и чтобы последний не мешал измерениям. Можно также охладить суспензию в ледяной бане и затем выполнить разведения и измерения или же предварительно подавить синтез белка, например с помощью хлорамфеникола. Все это снижает колебания количества биомассы в процессе измерений. В любом случае по окончании всех необходимых измерений готовят повторную серию последовательных разведений исходной суспензии. Данные первой и последней серий измерений должны совпадать. По мере получения данных их используют для построения рабочего графика, подобного изображенному на рис. 11.5, но в данном случае по оси абсцисс откладывают концентрацию суспензии в пробах (в процентах) относительно концентрации исходной суспензии. Нанося точки рабочего графика, получают представление о форме кривой. После нанесения каждой экспериментальной точки проверяют график, что помогает выявить ошибку наблюдения. Если подозревают, что имеется ошибка, разведения повторяют. В той части кривой, которая наиболее изогнута, делают дополнительные разведения. Повторные разведения позволяют немедленно обнаружить ошибку, тогда как дополнительные промежуточные разведения помогают лучше выявить кривизну графика. Значительных ошибок, обусловленных использованием пипеток, избегают, если исходную суспензию разводят таким образом, чтобы интервалы последующих разведений не были очень широкими и сравнительно большие объемы переносили в мерные сосуды. Получаемый рабочий график позволяет точно определять рост культуры, поскольку для расчета удельных скоростей роста и времени удвоения необходимо знать лишь относительное изменение биомассы во времени. Однако для многих других целей необходимо проводить не относительные, а абсолютные измерения. К тому же экспериментальные данные по измерению биомассы в абсолютных единицах могут быть точно воспроизведены в других лабораториях, и в связи с этим лучше проводить калибровку в абсолютных единицах.

Для калибровки в абсолютных единицах необходимо точно измерить в исходной суспензии некоторые параметры бактериальной биомассы или числа клеток, например сухой вес ([40]; см. также разд. 25.2.2), содержание нуклеиновых кислот (разд. 17.5), белков (разд. 17.6) или общего азота (разд. 17.6.9). Во всцх случаях необходимы параллельные пробы и качественный контроль. Для надежного подсчета жизнеспособных клеток используют много независимых разведений, а для микроскопического подсчета в счетной камере — много независимых заполнений этой камеры. Точность на этом этапе очень важна, так как она определяет судьбу последующего исследования.

С помощью спектрофотометрических данных строят график зависимости величин поглощения от числа клеток или биомассы (как показано на рис. 11.5). При наличии компьютера проводят наилучшую линейную, квадратичную или кубическую аппроксимацию. Имеющиеся в большинстве вычислительных центров программы содержат так называемый F-тест для выбора типа кривой, которая наилучшим образом соответствовала бы данным. Наиболее подходящую аппроксимированную кривую можно затем рассчитать с помощью простых программ на любом компьютере, в том числе микрокалькуляторе.

В нашей лаборатории для таких работ используются спектрофотометры типа Сагу или Zeiss с узким пучком света. Проверка ряда других спектрофотометров с суспензиями, содержащими бактерии различных размеров [30], показала, что при величинах клеток в интервале 0,4—2 мкм3 результаты в пересчете на сухой вес практически одинаковы. Поскольку для всех бактерий можно использовать одну и ту же кривую, ясно, что формулы пересчета приложимы ко всем неокрашенным прокариотам тех же размеров. Если измеряемое поглощение ниже значения 1,1, квадратичная кривая, проходящая через начало координат, адекватно удовлетворяет экспериментальным данным: А% =а№ — b%W2, где W — сухой вес бактерий, а и Ь%-—константы, используемые при данной длине волны Я. Эмпирические формулы для двух длин волн выглядят следующим образом

С увеличением длины волны коэффициент первого порядка W(a% ) снижается. Этот коэффициент можно вычислить и при других длинах волн, поскольку он обратно пропорционален длине волны во второй степени (точнее, в степени 2,11). Соответственно при других промежуточных длинах волн а% можно вычислить из уравнения

а^=2,439Д2'и.

При других длинах волн нет правила для определения b-к, но Кэйвенагу [26] удалось измерить эту величину при некоторых длинах волн. Эта константа зависит от формы клеток, внутренней гетерогенности суспензии, типа фотометра и т. д. в большей степени, чем а% . Фактически при высоких мутностях суспензии квадратичная аппроксимация удовлетворительна лишь частично. Именно поэтому, а также из-за осложнений при фотометрии предпочтительнее работать при значениях поглощения ниже 1. С увеличением длины волны снижается величина Ь% , многократно снижается рассеяние света на детекторе и улучшается линейность.

Для обычных подсчетов величины W можно использовать приведенные выше уравнения, выразив выход в микрограммах сухого веса на миллилитр:

№ = 461,81 (1_]/1—0,60881 Л420),

W— 9929 (1 — "|Л — 0,07347Лбео).

Последнее уравнение с той же точностью можно выразить иначе:

Г=364,74Л 660 + 6,7Л2660.

Все три выражения применимы для значения поглощения меньше 1.

Если бактерии не окрашены, длину волны выбирают на основании следующих соображений. Чем меньше длина волны, тем меньшую мутность способен регистрировать прибор, т. е. при этом он обладает повышенной чувствительностью; следовательно, при малых длинах волн могут измеряться низкие концентрации клеток. И наоборот, для некоторых целей желательна пониженная чувствительность, поскольку иногда представляют интерес плотные суспензии и желательно избегать дополнительного разведения. Более длинные волны предпочитают также использовать в связи с тем, что многие ростовые среды содержат вещества, поглощающие в голубой части видимого спектра, и поэтому кажутся желтыми или коричневыми. В связи с этим лучше проводить измерения при 660 нм, поскольку при этой длине волны контрольные пробы со средой почти не отличаются по поглощению от проб с водой. Использование более длинных волн нежелательно, так как для многих фотометров могут понадобиться дополнительные фотоумножители. При более коротких длинах волн химические изменения, вызываемые бактериями, окисление воздухом или различные режимы автоклавирования могут влиять на интенсивность светопропускания в сложных средах. В любом случае при работе с новой средой необходимо сравнить надосадочную жидкость, полученную после осаждения выросшей культуры, с исходной средой роста и определить, образуются или исчезают в процессе роста бактерий пигменты.

Фотометрию с окрашенными микроорганизмами проводят при определенной длине волны, которую выбирают таким образом, чтобы избежать поглощения в области спектра, соответствующей цвету клеток. Можно также выбрать такую длину волны, при которой поглощение света клеточными пигментами максимально, и затем определить количество биомассы, используя пигмент в качестве индикатора. Сложность в этом случае заключается в том, что содержание пигмента зависит от условий культивирования.

При отсутствии узколучевого спектрофотометра для постоянных каждодневных исследований можно пользоваться вышеприведенной формулой для сухого веса, снимая показания на приборе

страница 88
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.09.2017)