Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

ет, рассеиваемый во всех направлениях, кроме прямого, взаимно компенсируется. Остается идущий в исходном направлении пучок света, слегка замедленный относительно светового пучка, не проходящего через стекло.

11.4.1. Турбидиметрия

Бактериальные суспензии состоят из частиц, размеры которых лежат в пределах между атомами — с одной стороны и стеклянными линзами — с другой. Основная часть рассеиваемого суспензией света направлена почти (но не полностью) в том же направлении, что и падающий пучок (рис. 11.3). Интенсивность света, рассеиваемого атомом или очень малой частицей, обратно пропорциональна длине волны падающего света в четвертой степени. Поэтому мелкие частицы сильнее рассеивают голубой свет и лучше пропускают красный. Именно по этой причине небо кажется голубым, а дым и многие вирусные суспензии — голубоватыми. В случае оконного стекла свет, идущий в любом направлении, кроме исходного, взаимно компенсируется, и поэтому проходящий свет сохраняет свой исходный оттенок. В случае бактерий рассеянный свет примерно обратно пропорционален второй степени длины волны светового пучка исходного направления [28]. Если небо кажется голубым, а оконное стекло прозрачным, то бактериальная суспензия, подобно облаку, имеет промежуточный цвет и кажется белой, но не прозрачной. Поскольку она выглядит мутной, или непрозрачной, приборы используемые для измерения этого феномена, называют турбидиметрами (от лат. «turbidus» — мутный).

В бактериологии для измерения мутности широко принято использовать любой колориметр или спектрофотометр. В этих приборах измеряется первичный пучок света, который проходит через пробу и, не отклоняясь, попадает на фотоэлемент (рис. 11.4,Л). Обычно при этом сравнивается интенсивность света, проходящего через суспензию клеток и через среду без клеток. В идеальном фотометре пучок света должен быть очень узким, так чтобы фотоэлемента достигал свет, рассеиваемый только в прямом направлении, т. е. прибор должен иметь хорошо коллимированную оптику. Такой фотометр дает значительно большие величины поглощения, чем обычные приборы с плохо коллимированной оптикой, у которых значительная часть света, рассеиваемого суспензией, попадает на фотоумножитель (рис. 11.4,5). Поэтому их измерительная система реагирует таким образом, как будто света рассеивается меньше, чем в действительности.

Чем больше бактерий на пути света, тем ниже интенсивность света, проходящего через пробу. При низком уровне мутности это явление описывается простой геометрической зависимостью, поскольку интенсивность не-расееиваемого света убывает экспоненциально с увеличением числа бактерий. Геометрическую зависимость между мутностью суспензии бактерий и их количеством можно вывести, если рассмотреть суспензию, которая в 10 раз (по сравнению с исходной) снижает интенсивность проходящего света.

Предположим, что имеются две одинаковые суспензии в двух кюветах, расположенных таким образом, что свет последовательно проходит через обе кюветы. НаЛаша Фильтр Щепь суспензия бактерий Детектор

Рис. П.4, Схематическое изображение колориметра с фильтрами. Л. Колориметр с узким пучком: практически весь отклоняющийся от прямого направления рассеянный свет не попадает на фотодетектор. Б. Колориметр с широким пучком: часть отклоняющегося от прямого направления рассеянного света попадает на фотодетектор, из-за чего снижается чувствительность измерений.

сколько снизится интенсивность света после прохождения через две кюветы? Интенсивность света будет равна 0,1-0,1, т. е. 0,01 интенсивности исходного пучка, В идеальном случае такое же соотношение будет справедливо для одной кюветы с удвоенной концентрацией бактерий. Математически эта закономерность формулируется так: интенсивность нерассеиваемого света (/) равна интенсивности падающего света (/0), умноженной на \0~W/Wl0, где Ww — концентрация суспензии, которая в 10 раз снижает интенсивность проходящего света:

Так, при W= Wio / = 0,1/о, а при удвоении концентрации бактерий / = 0,01/е.

После логарифмирования обеих частей равенства имеемIg///0=lg/0//=W10.

Сходная зависимость (закон Ламберта — Бэра; разд. 16.1.1) справедлива для поглощения света окрашенными пробами. Ее можно вывести аналогичным путем. Большинство приборов для определения мутности имеет шкалу, градуированную в \g(IJI) [эта величина называется поглощением (адсорбцией, А) или оптической плотностью (OD)]. Термин «оптическая плотность» раньше был распространен (его используют как для мутных, так и для светопоглощающих растворов), но мы будем пользоваться более новым термином — «поглощение». В идеальном случае в соответствии с вышеприведенным уравнением график зависимости величины А бактериальной культуры от числа клеток имеет вид прямой линии, проходящей через начало координат. Ее можно описать уравнением

где К—наклон (равный l/Wio) и A~\gIofI. Как показано на рис. 11.5, истинное поглощение увеличивается меньше, чем предсказывает формула (см. также разд. 16.1.1), так как свет, рассеивающийся от одной бактерии, попадает на другую и вновь рассеивается таким образом, что возвращается в фотоумножитель. Кроме того, в результате взаимодействия бактерий благодаря броуновскому движению они распределяются более равномерно и меньше рассеивают проходящий пучок света (подобно оконному стеклу).

Приведенные рассуждения позволяют сделать некоторые практические выводы, касающиеся измерения мутности суспензий. Теоретические [28, 29] и экспериментальные [20, 28, 30, 31] исследования свидетельствуют о том, что разбавленные суспензии большинства бактерий независимо от размера клеток характеризуются почти одинаковым поглощением на единицу сухого веса. Однако в пересчете на частицу или на колониеобразующую единицу величины поглощения зависят от размера клеток. Было предложено следующее приближенное правило: поглощение прямо пропорционально величине сухого веРис. П.5. Поглощение (при 420 нм) как функция концентрации бактериальных клеток. Штриховая линия — теоретическая кривая. Сплошная линия — экспериментальная кривая, полученная с пятнадцатью разведениями бактериальной культуры (концентрации клеток измеряли по сухому весу биомассы). Она построена путем аппроксимации квадратичной кривой, проходящей через нулевую точку.

са [28]. Это правило приложимо к коккам и палочкам и является первым приближением более точного правила, которое гласит, что рассеяние первичного пучка света пропорционально среднему объему клеток в культуре в степени 4/з- Объекты, которые мельче бактерий (например, вирусы), или бактерии, суспензия которых имеет голубоватый оттенок, плохо подчиняются этим правилам. Более крупные объекты, например дрожжи, нитевидные бактерии и скопления бактерий, суспензии которых выглядят мутными и не обязательно окрашенными, тоже могут не подчиняться рассматриваемому правилу. Там же, где правило приложимо, константа пропорциональности, связывающая измеренное в любом хорошо коллимированном фотометре поглощение с величиной сухого веса, будет одинаковой для разных объектов. У хороших фотометров фотоумножитель находится на значительном расстоянии, и благодаря отличной коллимации детектор в них улавливает только узкий пучок света. Такими свойствами обладают модели фотометров Zeiss и Сагу. Другие фотометры можно оценить по чертежам, конструкциям их оптических систем, а также путем прямого сравнения поглощения в них клеточной суспензии с поглощением в спектрофотометрах Zeiss или Сагу.

Если спектрофотометр или размер микроорганизма не удовлетворяет упомянутым критериям, во многих случаях надежные измерения можно проводить с помощью стандартной кривой, построенной на основании абсолютного или относительного поглощения. Сложности возникают только тогда, когда физические или биологические условия сравниваемых образцов варьируют, поскольку в этом случае экспериментатор не всегда уверен, можно ли использовать одну и ту же стандартную кривую.

Все это приложимо только к разбавленным суспензиям. При величинах поглощения выше 0,3 и при длине волны 500 нм или меньше следует принимать во внимание отклонения от закона Ламберта — Бэра (см. пример, приведенный на рис. 11.5). Этот вопрос подробно обсуждается в работе [26]. О таких отклонениях часто забывают, и это очень осложняет анализ микробиологической литературы по турбидиметрии. Одним из способов обойти эту проблему является ограничение плотности культуры или разведение ее до плотности ниже 0,3. Однако фотометрические измерения на этом уровне не точны, а разведение с помощью пипеток может явиться источником дополнительных ошибок. Для измерения малых поглощений крайне важно, чтобы кюветы были тщательно подобраны, очень хорошо промыты и правильно установлены в спектрофотометре. Предпочтительнее проводить измерения при высоких плотностях культуры и затем корректировать их на отклонение от закона Ламберта — Бэра.

Методика

Парадоксально, но при турбидиметрическом определении мутности не существует строго определенной методики. Некоторым исследователям удается получить надежные результаты с помощью любого доступного прибора. Дорогие спектрофотометры характеризуются высокой точностью, стабильностью, точной настройкой длины волны и, что самое важное, широким диапазоном измерений поглощения. Это сказывается при измерении слабых поглощений, поскольку такие приборы обладают хорошей электронной стабильностью и повышенной воспроизводимостью положения кювет; сами кюветы имеют тщательно подобранные размеры, а стенки их строго параллельны. Измерение плотных суспензий также лучше проводить на высококачественных приборах, поскольку рассеянный свет при этом очень незначителен. Кро ме того, у них имеются устройства для настройки темно-вого тока, что позволяет более точно снимать показания.

Какие фотометры предпочтительнее для измерения мутности: однолучевые или двухлучевые? Проверочный тест заключается в том, что фотоумножитель закрывают шторкой или на пути луча помещают непрозрачный объект, а затем следят за кинетикой уменьшения свето-пропускания. В простых дешевых приборах наблюдается очень быстрое падение светопропускан

страница 87
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)