Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

едленно развивающимися или поздно появляющимися колониями. Еще одной проблемой является поддержание необходимой концентрации С02, поскольку в СОг могут нуждаться даже организмы, выделяемые обычно в отсутствие высоких концентраций этого газа. Эта зависимость особенно наглядно выявляется в случае нанесения на агар отдельных редких клеток из разбавленных суспензий и при инкубации в обычной лабораторной атмосфере. Хотя эти проблемы возникают далеко не всегда, о них надо помнить.

7. Наблюдение за чашками начинают до того, как колонии разовьются в полной мере. Часто вырастает слишком много колоний. Тогда прибегают к дополнительным разведениям и посевам либо к подсчетам (с помощью лупы) мелких недоразвившихся колоний, опасность слияния которых меньше, нежели в случае крупных развитых колоний.

8. Подсчет колоний следует вести при хорошем освещении, однако соответствующее оборудование далеко не всегда придается к обычным счетчикам колоний. Иногда увеличительные линзы укрепляют в оправе очков ил» используют лампы с линзами. Счет ведут либо «вручную», отмечая чернилами колонии на дне чашки Петри, либо с помощью электронного счетчика или телевизионного сканирующего устройства. Отдельные колонии на поверхности агара можно отмечать прикосновением к ним специального красящего карандаша. Далеко не все виды таких карандашей способны окрашивать колонии на агаре. Лучше всего использовать окрашивающие карандаши фирмы Eberhard Faber Mongol, причем одни красители (например, French Green № 898) окрашивают колонии лучше, чем другие. Для дифференциального подсчета можно использовать несколько красителей. Некоторые исследователи предпочитают считать единичные колонии в уме, а десятки откладывают на клавишном счетчике. При работе с электронными сканирущими счетчиками особое внимание уделяют тому, чтобы избежать ошибок, источником которых могут служить частички грязи или не видимые невооруженным глазом дефекты в стеклянных или пластмассовых чашках. Для повышения контрастности колоний и уменьшения числа ложнопозитивных случаев в агар вводят красители.

11.2.2. Посев в многослойный агар

1. Готовят чашки Петри с первым слоем агаризован-ной среды (1,5% агара, толщина слоя около 0,4 см). Как первую, так и последующие среды наливают в чашки, установленные на строго горизонтальной поверхности (с помощью уровня).

Заполняют небольшие (13X100 мм) пробирки 2,5— 3 мл 0,7%-ного расплавленного агара. Удобно иметь приготовленные заранее бутыли с агаровой средой, содержащей основные компоненты. Агар в бутылях расплавляют (это можно сделать в микроволновой печи лри наличии определенного навыка, следя за тем, чтобы агар бурно не вскипал) и добавляют к нему необходимые питательные компоненты, красители и ингибиторы. Аликвоты готовой горячей среды переносят пипеткой в предварительно прогретые до 45 °С серологические пробирки (13ХЮ0 мм). Работа с горячей средой снижает вероятность заражения посторонними бактериями. При 45 °С агар остается жидким в течение нескольких часов. При 50 °С это время еще больше, однако при этой температуре гибнут многие бактерии.

2. Пробы с культурой разводят, как описано выше {разд. 11.2.1).

3. Переносят чашки Петри в комнату с температурой 25—30 °С.

4. Делают отметку на наружной стороне серологической пробирки и наносят на внутреннюю поверхность пипеткой 0,1 мл разведенной пробы.

5. Расплавленный агар немедленно выливают из пробирки в чашку Петри таким образом, чтобы, вытекая, он смыл приставшие к стеклу клетки на месте внесения лробы. Это позволяет не только перенести все клетки в чашку, но и равномерно перемешать их с агаризованной средой; кроме того, при этом уменьшается адсорбция клеток на стекле.

6. Чашку наклоняют и покачивают, чтобы расплавленный агар, содержащий клетки, равномерно покрыл всю поверхность первого слоя.

7. Чашку помещают на установленный по уровню столик и дают агару застыть.

8. Эту процедуру проводят и с другими чашками, необходимыми в опыте.

9. Добавляют пипеткой или выливают из пробирки 2,5—3 мл 0,7%-ного расплавленного агара на застывшую поверхность и покачиванием равномерно распределяют его. Чашки помещают на установленный по уровню столик и дают застыть третьему слою агара.

10. Чашки можно инкубировать в любом положении,

поскольку при использовании этого метода возможность заражения и высыхания значительно ниже, чем при методе посева в чашках на поверхность агара.

11. Следят за ростом колоний и просчитывают их. Колонии, растущие под поверхностью, более компактны, имеют четко очерченные края и меньший размер по сравнению с обычными поверхностными колониями. Их труднее считать, однако увеличительные стекла или специальные насадки на очки помогают снизить напряжение глаз в процессе счета.

Дополнительные затраты труда, необходимые при посеве в многослойный агар, оправдываются, когда вырастает очень много колоний. Равномерность распределения колоний по чашке определяют визуально. Если распределение действительно равномерно, просчитывают колонии в какой-либо части чашки и затем получают общее их число на чашках перемножением. Использование бинокулярной лупы позволяет избежать трудностей, связанных с подсчетом мелких и близко расположенных колоний, и в ряде случаев «спасти» эксперимент, узким местом которого оказался именно этап подсчета колоний.

11.3. НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНЫЕ ЧИСЛА

Концентрация живых клеток может быть определена методом наиболее вероятных чисел (НВЧ), заключающимся в математической оценке вероятности присутствия жизнеспособных клеток в серийных разведениях, в которых рост уже не регистрируется.

Готовят несколько параллельных разведений клеток в ростовой среде и после инкубации учитывают пробирки с выраженным бактериальным ростом. Полагают, что в пробирки, в которых отсутствует рост, не было внесено даже одной клетки, способной расти. Поскольку распределение частиц должно подчиняться формуле Пуассона (см. ниже), среднее число клеток в таком разведении можно вычислить по формуле Р0 = е~т, где т—среднее, а Р0 — отношение количества пробирок, где отсутствует рост, к общему числу пробирок. Затем среднее умножают на фактор разбавления и на объем инокулята, который дает заметный рост исходной культуры. Метод НВЧ статистически весьма неэффективен, поскольку каждая пробирка соответствует только небольшой части поверхности чашки Петри. В связи с этим приходится либо использовать много пробирок, либо удовлетвориться весьма приблизительным результатом.

Одним из преимуществ метода НВЧ является возможность его использования в отсутствие способа культивирования бактерий на твердой среде. Второе преимущество заключается в том, что он удобен в случае высокой вариабельности кинетики роста. Предположим, что некоторые клетки из смешанной культуры растут быстро, образуя на агаре крупные колонии, которые, распространяясь по поверхности, маскируют появляющиеся позже мелкие колонии интересующего нас микроорганизма. Хотя количество таких мелких колоний может быть больше, их невозможно учесть на чашках из-за присутствия колоний более подвижных или быстрее растущих бактерий. Третье преимущество метода НВЧ состоит в том, что в присутствии не представляющих интереса организмов и в отсутствие подходящего метода селекции его можно использовать для выявления легко обнаруживаемых продуктов (например, пигментов или антибиотиков), продуцируемых изучаемыми микроорганизмами. В этом случае, несмотря на более выраженный рост контаминирующих микроорганизмов, количество исследуемых батерий определяют по числу пробирок, где образование характерных продуктов отсутствует. И наконец, метод НВЧ используют в случае, если агар или другие отвердители содержат некоторые факторы (например, тяжелые металлы), которые изменяют достоверность подсчета или взаимодействуют с изучаемыми бактериями.

Подсчет по методу НВЧ помогает ускорить современная лабораторная техника. Существуют, например, специальные устройства для заполнения лунок в пластмассовых пластинах, имеющих до 144 лунок. Для подсчета лунок, в которых рост отсутствует, используют сканирующие устройства, а для заполнения небольших пробирок широко применяются автоматические и полуавтоматические пипетки. Благодаря этому появляется возможность проверять значительно больше культур, чем с помощью классических методов, в которых используют фиксированное число разведений и фиксированное число

Рис. 11.2. Ошибки (коэффициент вариаций), возникающие при использовании метода наиболее вероятных чисел (НВЧ). как функции относительного числа сохранивших стерильность пробирок (нижняя абсцисса) и среднего числа клеток иа одну пробирку (верхняя абсцисса). Соответствующие оптимумы имеют место при числе стерильных пробирок 20,8 и среднем числе клеток 1,59. Пробирки (Л) готовят при одном разведении.

пробирок. Все это заставляет отказаться от старых таблиц и приемов вычислений и искать новые подходы к проблеме и новые методы расчета.

Несмотря на статистическую неэффективность, при работе с одним разведением метод НВЧ наиболее точен в том случае, когда среднее число способных неопределенно долго расти бактериальных клеток составляет 1,59 на пробирку [18]. Это соответствует положению, когда 20,8% пробирок остаются стерильными (рис. 11.2). Если предполагаемое число клеток в исходной суспензии известно довольно точно, то все имеющиеся пробирки следует засеять из разведения культуры, соответствующего величине 1,59. Точность быстро падает при отклонении от оптимальной величины, особенно при выходе за пределы интервала 1—2,5 клетки на пробирку. Так, работа с 10-кратным (по сравнению с оптимальным) разведением не дает никакой информации о среднем числе клеток. Соответственно если предполагаемое число жизнеспособных клеток находится в пределах 5-кратного разведения, то целесообразно использовать все пробирки для получения разведения, предположительно соответствующего 1,59 клетки на пробирку, и исходить при этом из предположения, что истинное число жизнеспособных клеток находится в середине возможного интервала.

Обычно, однако, ориентировочная информация отсутствует, и необхо

страница 85
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.11.2017)