Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

арительно тщательно промытый мембранный фильтр, который затем переносят на питательный агар в чашке или на фильтровальную бумагу, пропитанную концентрированной питательной средой.

Вариантом метода посева в агар является посев на агар (или в агар) во вращающиеся пробирки и микротрубки [44]; при этом мелкие колонии можно рассматривать в микроскоп [45]. Имеются и другие варианты перечисленных выше методов. Использование автоматического подсчета колоний создает дополнительные специфические ограничения при работе этими методами, однако оно позволяет быстро и без ошибок, свойственных исследователю, просчитывать колонии в чашках Петри.

Ниже описываются два метода. Один из них — это метод посева в чашки на поверхность агара, при котором все выросшие колонии являются поверхностными. Именно на поверхностных колониях изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. Подповерхностные колонии часто отличаются по цвету от поверхностных, так как они развиваются в других условиях аэрации и, следовательно, характеризуются другой способностью к кислотообразованию и другим окислительно-восстановительным потенциалом. Второй метод — посев в многослойный агар — обладает своими преимуществами: поскольку здесь все колонии развиваются под слоем агара, они невелики, компактны и могут интенсивно окрашиваться. В чашке в данном случае может вырастать значительно больше колоний по сравнению с другими методами, причем вероятность их слияния невелика. Можно просчитать несколько тысяч колоний на чашке и получить достоверные результаты. Поскольку при использовании других методов основная сложность заключается в подсчете нарастающего числа колоний на чашку, совершенно очевидно, что в этом плане данный метод явно следует предпочесть другим. Существует правило, согласно которому оптимальное для подсчета число колоний на чашку лежит в пределах от 30 до 300. Нижний предел устанавливается из соображений статистической достоверности, а верхний — из-за опасности слияния индивидуальных колоний. Указанный 10-кратный диапазон неудобен для многих экспериментов, поскольку в ряде случаев при разведении трудно заранее определить, будет ли число колоний входить в указанный сравнительно узкий диапазон. Дополнительные усилия по приготовлению чашек с многослойным агаром окупаются тем, что вырастающие в этом случае колонии можно считать в широком диапазоне (от 30 до 2000). Вторым важным преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом питательной среды. Первым слоем в чашки Петри можно разлить минимальную среду с агаром и в таком виде хранить их неопределенно долго. Может храниться также подготовленная для посева и разлитая по пробиркам3 минимальная полужидкая среда с агаром. В агар, используемый для верхнего слоя, можно добавлять необходимые питательные вещества в 10—50-кратном избытке. При необходимости к полужидкому агару добавляют красители или хромогенные субстраты, облегчающие обнаружение колоний.

Попыткам ускорить и автоматизировать измерения роста посвящен ряд статей и книг [2, 23]. Однако эта область только начинает развиваться, и мы ее здесь обсуждать не будем.

Некоторые микроорганизмы обладают высокой чувствительностью к ряду веществ, присутствующих в агаре. По этому вопросу опубликовали прекрасный обзор Мейнелл и Мейнелл [5]. Если под действием этих веществ микроорганизм повреждается, то не исключено, что он нуждается в специальных питательных добавках. Этой проблеме посвящен 26-й симпозиум Общества общей микробиологии [19]. Обычно при проведении эксперимента исследователь должен решать, какие условия культивирования ему использовать — те ли, при которых наблюдается высокое выживание, или те, при которых оно низкое. Появление генетически дефектных организмов порождает свои проблемы, например проблему способности мутантов с поврежденной системой репарации образовывать колонии, поддающиеся счету [14].

Проблемы подсчета клеток в культурах строгих анаэробов обсуждаются в работах [15, 24, 25].

11.2.1. Посев в чашки на поверхность агара

Подходящую агаровую среду разливают в стеклянные или пластмассовые чашки Петри (диаметром 9 см). Из ряда методик заполнения и подсушивания чашек можно рекомендовать следующую.

1. После автоклавирования и добавления термола-бйльных субстратов (Сахаров, красителей, антибиотиков, хромогенных субстратов) закрытую емкость с расплавленным агаром помещают в лоток с горячей (45—50 °С) водопроводной водой. Агар быстро и равномерно охлаждается, достигает температурного плато выше точки застывания агара (обычно для 1 л агара достаточно инкубации в течение 30 мин). При этом образования геля возле стенок емкости не происходит. Такой достаточно охлажденный агар при разливе дает лишь немного конденсата на внутренней поверхности крышек чашек Петри.

2. Агар в чашки Петри заливают возле зажженной бунзеновской горелки. Если на поверхности агара появляются пузыри, пламя горелки немедленно направляют на эти участки, пока пузыри не лопаются. Обычно для чашки с диаметром 9 см достаточно 15—20 мл агара, что соответствует высоте слоя 0,24—0,32 см. Чем толще слой, тем менее контрастно выглядят колонии на агаровом фоне. В тонких слоях агара из-за ограничения некоторых питательных субстратов или локального подсыхания агара могут вырастать мелкие колонии и может уменьшаться их число, особенно в истонченных участках агарового слоя.

3. В зависимости от влажности чашки подсушивают при комнатной температуре 12—24 ч.

4. Чашки хранят при 4°С в закрытых пластмассовых контейнерах неограниченное время.

Посев производят следующим образом.

1. На основании имеющейся информации готовят разведения культуры таким образом, чтобы получить после инкубации 100—200 колоний на чашку. Для подсчетов, однако, можно использовать и чашки в более широком диапазоне числа колоний (30—300). Если колонии мелкие, удается просчитать до 500 колоний в одной чашке. При работе со стеклянными чашками и пипетками для разведения суспензий бактерий используют растворы, препятствующие адсорбции клеток на стекле, например растворы с высокой ионной силой, с низким рН (4—5) или содержащие немного нетоксичного анионного детергента. Можно также использовать пластмассовые чашки Петри и пластмассовые наконечники на пипетки.

2. Разведения проводят несколькими способами. Традиционно к 1 мл про^ы добавляли большие (99 мл) объемы соответствующего стерильного раствора; однако с усовершенствованием техники все чаще стали использовать небольшие объемы, экономя реактивы и время, необходимое для перемешивания. Современные полуавРис. 11.1. Шпатели Слева: изогнутая скрепка для бумаги, нижняя часть которой помещена в тефлоновую трубку. Справа пастеровская пипетка с оплавленным концом, изогнутая в двух местах. Ручки обоих устройств изгибают, исходя из соображений удобства. Оба шпателя обладают низкой теплоемкостью; левый шпатель благодаря присутствию тефло-новой трубки сорбирует меньше бактерий

томатические пипетки с пластмассовыми наконечниками позволяют работать с очень малыми объемами, однако такие пипетки трудно стерилизовать. Для многих целей можно использовать 0,1-миллилитровую серологическую пипетку и добавлять 0,1 мл культуры к 0,9 или 4,9 мл раствора, которым разводят пробы (в пробирках 13Х ХЮО мм), или к 9,9 мл этого раствора (в пробирках 16X150 мм). При оптимальном разведении облегчается перемешивание.

3. 0,1 мл разведенной культуры наносят на поверхность агара в чашке Пе(три. Для этого 2—3 капли капают на поверхность, а оставшуюся в пипетке жидкость выдувают (в автоматической пипетке нажимают поршень до упора). Это делают быстро, поскольку клетки имеют тенденцию немедленно прикрепляться к твердому субстрату.

4. Шпатели (рис. 11.1) стерилизуют погружением в спирт, удаляют избыток последнего и обжигают в пламени горелки. Шпатель можно изготовить из большой скрепки для бумаг (Giant Gem. Nestling). Скрепку изгибают, как показано на рисунке, надевают на ее конец специальную тефлоновую трубку (№ 16, Small Parts, Inc., Miami, Fla.) и слегка нагревают на огне, чтобы трубка плотно охватила проволоку. Часть скрепки, используемую в качестве ручки, можно изогнуть наиболее удобным образом. По сравнению с толстыми стеклянными палочками такой шпатель обладает низкой теплоемкостью, быстро остывает и значительно более инертен по отношению к бактериальным клеткам. Подобный шлатель можно так же быстро изготовить из пастеровской пипетки.

5. Культуру равномерно распределяют по агару в чашке, стараясь покрыть всю его поверхность вплоть до периферии. Равномерный посев требует определенного опыта. После инкубации проверяют распределение колоний на всех чашках, чтобы убедиться в равномерности посева. Лучшими для оценки равномерности посева являются чашки с наибольшим числом выросших колоний, хотя подсчет колоний в этом случае затруднителен. Если количество колоний, выросших вокруг наносимых на агар капель суспензии, выше, чем на остальной поверхности, то технику распределения следует улучшить. Капли влаги на крышках чашек Петри удаляют интенсивным встряхиванием крышек. Чашки с разлитым в них агаром следует подсушивать до тех пор, пока капля жидкости (0,1 мл), наносимая пипеткой, не поглотится агаром в течение 15—20 с.

6. Перевернутые чашки инкубируют при постоянной температуре в хорошо термостатируемой комнате или камере (разд. 6.3). Лучше использовать закрытые контейнеры, однако их не следует перегружать чашками. Если тем не менее без этого не обойтись, увеличивают время для выравнивания температуры чашек и камеры, что особенно важно при работе с температурочувстви-тельными мутантами. Инкубация в закрытых контейнерах позволяет также избежать токсического воздействия вредных газов, которые могут присутствовать в атмосфере термостатируемых помещений общего назначения (например, паров уксусной кислоты, используемой для обесцвечивания гелей). Непрозрачные контейнеры защищают светочувствительные компоненты сред и красители от инактивации светом. Наконец, в контейнерах среда в чашках не высыхает, и поэтому такие чашки пригодны для наблюдения за м

страница 84
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.09.2017)