Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

Лучше подсчитывать количество клеток в определенных квадратах, например в четырех угловых, и в квадратах, расположенных по диагонали. Это позволяет избежать подсчета одного квадрата дважды, а также усреднить возможный геометрический градиент клеток в камере.

8. Число клеток определяют по следующей формуле: щее число клеток в квадрате, заново фокусируют объектив на исходной поверхности и затем передвигают камеру.

11.1.2. Электронный подсчет

Счетчик клеток типа Coulter Counter (Coulter Electronics, Hialeah, Fla.), его аналоги, производимые другими фирмами, а также аналогичные приборы, создаваемые в лабораториях, в последние 25 лет оказали значительное влияние на развитие бактериологии. Такие приборы давно и широко используются в клинической гематологии. Они весьма удобны для подсчета клеток простейших и немицелиальных дрожжей, но непригодны для мицелиальных организмов. Хотя применение таких счетчиков привело к созданию новых концепций в бактериологии, их использование в случае мелких палочкообразных бактерий крайне затруднительно. При участии физиков и инженеров проводятся исследовательские работы с целью улучшения электронного метода подсчета и повышения его надежности. О реальных трудностях, с которыми столкнулись при использовании метода, свидетельствует, например, тот факт, что исследователи» принимавшие участие в его разработке, больше не пользуются им. В настоящем руководстве мы обсудим лишь принципы метода, основные трудности при работе^ним и пути их преодоления. По остальным вопросам мы отсылаем читателя к опубликованным работам. После этого читатель сам сможет сделать вывод о применимости метода электронного подсчета для решения различных задач в бактериологии.

Принцип электронного подсчета заключается в следующем. Разбавленная бактериальная суспензия подается через очень маленькое отверстие (жиклер), соединяющее две камеры с жидкостью. В каждой камере с помощью электродов измеряется электрическое сопротивление. Несмотря на то что электропроводность среды достаточно велика, размер жиклера настолько мал, что электрическое сопротивление в нем несоизмеримо выше, чем в остальном объеме. Когда частица переносится с жидкостью через жиклер, сопротивление возрастает еще сильнее, поскольку электропроводность бактерий ниже, чем среды. Эти изменения сопротивления улавливаются с помощью измерительной цепи и превращаются в импульс напряжения или силы тока. Подсчет импульсов в электронной цепи подобен подсчету радиоактивности, причем очень слабые импульсы элиминируются (отсекаются) с помощью дискриминатора. Слишком сильные импульсы могут быть отсечены с помощью второго дискриминатора («верхнего уровня»), если предполагают, что они имеют своим источником частички грязи или другие примеси. В усовершенствованных счетчиках импульсы анализируются по их величине и запоминаются в многоканальном анализаторе. При необходимости эти данные извлекаются из памяти и переносятся на гистограмму, где можно определить число частиц, их среднюю величину и среднеквадратичное отклонение. Все данные рассматриваются в совокупности, и в ходе анализа дискриминируются очень сильные или очень слабые импульсы. Подобные приборы требуют в процессе подсчета принудительной подачи точно измеренных объемов жидкости через жиклер. Обычно это достигается за счет вытеснения жидкости, находящейся в контакте с ртутным столбиком; при этом ток эффективно проходит через ртуть, но не через поступающую среду.

При использовании электронного метода подсчета сталкиваются с тремя важными проблемами. Первая из них заключается в том, что, поскольку некоторые бактерии очень малы (меньше 0,4 мкм3), импульсы сопротивления, возникающие при их прохождении через жиклер, сравнимы с величиной «шума» (фона), образующегося из-за турбулентности проходящей через жиклер жидкости. Можно установить дискриминирующее устройство, «срезающее» турбулентные шумы, однако при этом не исключена потеря некоторой информации об истинном числе клеток, особенно в случае присутствия только что разделившихся клеток. Другой способ учета турбулентных шумов состоит в измерении «шумов» контрольных (не содержащих клеток) проб и вычитании их из измеряемых импульсов. Однако хорошо известно, что пробы, не содержащие клеток, значительно отличаются друг от друга по импульсам сопротивления. К тому же турбулентность в потоке жидкости устанавливается сама по себе, сохраняется некоторое время, а затем меняется.

Наконец, вероятность общей ошибки возрастает, если контрольные пробы обладают статистически значимыми различиями (разд. 11.5.5). Не возникает проблем лишь при работе с определенными бактериями, растущими на богатой среде, где даже вновь образованная клетка дает импульс больший, чем турбулентный шум, или при работе с крупными бактериями типа Azotobacter agilis, клетки которых в несколько раз крупнее клеток Е. coli.

Вторая проблема заключается в том, что после деления дочерние клетки не всегда в достаточной степени отделяются друг от друга. Эту проблему, а также проблему, связанную с тенденцией к образованию нитевидных клеток, можно исключить, если правильно подобрать микроорганизм и условия его роста. Совершенно очевидно, что выбор Е. coli для физиологических и генетических исследований в значительной мере был обусловлен низкой способностью клеток этого организма к агрегации, сцеплению дочерних клеток между собой, образованию цепочек и нитей. Для диспергирования агрегатов, отделения разделившихся дочерних клеток и фрагментирования нитей используют интенсивное перемешивание в миксере типа Vortex или мягкую ультразвуковую обработку. Следует, однако, отметить следующее: для доказательства того, что все частицы представляют собой отдельные клетки, а разрушение клеток незначительно, счетчик типа Coulter Counter отнюдь не лучше, чем микроскопия с масляной иммерсией.

Существует также связанная с предыдущей проблема (разд. 11.5.5) совместного прохождения через жиклер более чем одной частицы в течение короткого времени, достаточного для того, чтобы электронное устройство зарегистрировало прохождение более чем одной крупной частицы. Ее можно решить, используя различные разведения суспензии, поскольку, чем больше разведение, тем меньше вероятность совместного прохождения (см. ниже). Особенно важно эту проблему учитывать при изучении распределения клеток по размерам.

Третьей важной проблемой, возникающей при работе с электронными счетчиками, является засорение жиклера. Если увеличить его диаметр, то изменение сопротивления при прохождении частицы составит лишь незначительную часть общего сопротивления. Поэтому для под

счета мелких палочковидных бактерий типа Е. coli диаметр жиклера должен быть не больше 12—30 мкм. Видимо, за выбор подходящего жиклера, который позволяет достаточно сильно увеличивать сигнал, приходится расплачиваться повышенным шумом и мириться с возможностью засорения жиклера. Одним из способов борьбы с засорениями является ультрафильтрация всех растворов. Можно также дать отстояться растворам в течение долгого времени в бутылях с сифоном и затем слить растворы, лишенные частиц. Важную роль играет выбор растворителя, не способствующего образованию частиц, например, Кубичек [38] рекомендует использовать ОД н. НС1. НС1 обладает хорошей летучестью и не выщелачивает из стекла вещества, которые в дальнейшем могут образовывать осадки. Однако на практике проблема засорения решается далеко не просто, причем при использовании модификаций методов, разработанных для точного определения размеров клеток, она усугубляется.

Введение в практику электронного счетчика системы Coulter Counter оказало влияние на изучение роста бактерий, причем главным образом благодаря принципиальной возможности измерять распределение клеток по размерам и в меньшей степени возможности подсчета клеток. На практике крайне сложно точно измерить размер клетки из-за импульсной природы сопротивления, генерируемого проходящей через жиклер частицей. Были предприняты попытки преодолеть эту трудность, используя сравнительно длинные (100 мкм) поры [37]. Хотя при этом снимаются некоторые физические ограничения, с замедлением потока жидкости в длинной поре увеличивается возможность засорения. В другом подходе используется специальное гидродинамическое фокусирование растворов, обеспечивающее движение бактериальных клеток очень близко к центральной оси поры и окружение их жидкостью, не содержащей частиц [50, 52, 55].

Дополнительную информацию об этом методе можно найти в работах [2, 17, 38], а также в инструкциях, прилагаемых к приборам фирмами-изготовителями.

11.2. ПОДСЧЕТ КОЛОНИЙ

По существу бактериология превратилась в экспериментальную науку начиная с того момента, когда Роберт Кох по совету Фанни Хессе впервые в лабораторной практике использовал чашки с агаровой средой. Это позволило не только осуществлять клонирование чистых культур, но также подсчитывать количество колоний, образующихся из отдельных «жизнеспособных клеток». Существует много вариантов этого метода. 1. Метод посева в агар: пробу вносят пипеткой в пустую стерильную чашку Петри, в которую затем вливают расплавленный, но остуженный до температуры 45°С агар; содержимое осторожно перемешивают и дают агару застыть. 2. Метод посева на поверхность агара: небольшие (0,1 мл) объемы разбавленной культуры вносят пипеткой непосредственно на поверхность затвердевшего агара в чашке Петри и затем клетки распределяют по поверхности с помощью стеклянного или тефлонового шпателя. 3. Метод посева в тонком слое: разбавленную культуру вносят в пробирки с небольшим объемом (2,5— 3,5 мл) расплавленного агара (0,6—0,75%), затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшего агара, и дают застыть верхнему слою. 4. Метод посева в многослойный агар напоминает предыдущий. Он отличается лишь тем, что на верхний слой засеянного застывшего агара наливают или наносят пипеткой дополнительный слой стерильного агара. Поэтому все колонии развиваются под поверхностным слоем агара. 5. Метод мембранных фильтров: разбавленную культуру фильтруют через соответствующий предв

страница 83
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)