Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

что мицелиальный тип роста, вероятно, отклоняется от экспоненциального и зависит от геометрии роста и природы инокулята. Во встряхиваемых культурах рост зависит от скорости встряхивания, которая влияет на склонность мицелия распадаться на более мелкие фрагменты.

Клеточная дифференцировка

Процесс превращения клеток энтеробактерий из крупных и богатых РНК форм в мелкие и бедные РНК клетки по достижении стационарной фазы характеризуется рядом свойств, присущих клеточной дифференци-ровке. Правда, в бактериологии существует много более четких примеров дифференцировки, например превращение палочек в кокки, вегетативных клеток бацилл в эндоспоры, а также образование микроорганизмами экзоспор, цист и почек. При определенных обстоятельствах формирование нитевидных клеток можно также рассматривать как процесс дифференцировки. Рассмотренные выше изменения клеток и их возможная обратимость создают потенциальные причины ошибок при измерениях роста микроорганизмов.

Адсорбция на поверхности

Многие бактерии в результате адаптации или мутации могут приобретать высокое сродство к поверхностям, в частности к стеклу (эффект обрастания). Прикрепление микроорганизмов к стенкам сосуда явилось причиной неудач некоторых экспериментов с хемостатными культурами. Именно поэтому при длительных контактах микроорганизмов со стенками сосудов для культивирования следует использовать пластмассу или тефлон [31]. Другие способы уменьшения способности клеток расти на стенках сосудов заключаются в использовании фторуглеродных покрытий или больших объемов культуры в крупных емкостях, а также интенсивного перемешивания и частых пересевов бактерий в новые стеклянные сосуды. Кроме того, эффект обрастания может быть снижен в результате использования детергентов, силиконового покрытия стенок и сред с высокой ионной силой.

В частности, с этой проблемой приходится сталкиваться при разведении культуры для измерений высокочувствительными методами, например для микроскопии или подсчета колоний в чашках. Эта проблема обсуждается также в разделах, посвященных соответствующим методам (разд. 11.1.1, 11.2.1 и 25.1).

Гетерогенное окружение

Измерение роста микроорганизмов в естественных условиях связано с большими трудностями [9]. Как правило, в природных условиях встречаются смешанные культуры, в которых бактерии прикрепляются друг к другу, к частичкам почвы и листьям. В этих случаях рост измеряют четырьмя основными методами. Первый из них заключается в определении фиксации 14С-двуоки-си углерода растущей биомассой [53]. Второй предусматривает идентификацию клеток с реплицирующейся ДНК, меченной 3Н-тимидином, по радиоавтографии [10]. В третьем методе для идентификации микроорганизмов в образцах почвы применяют флуоресцирующие антитела [48]. Наконец, информацию о росте микроорганизмов можно получить с помощью усовершенствованной масс-спектрометрии газов, выделяемых образцами почвы [41]. Подробное обсуждение этих вопросов не входит в задачи настоящего руководства.

Рост бактерий рассматривается также в гл. 10 и в работах [1—7].

11.1. ПРЯМОЙ ПОДСЧЕТ

11.1.1. Подсчет в микроскопе

Подсчет в микроскопе представляет собой широко распространенный быстрый и дешевый метод, оборудование для которого имеется в каждой бактериологической лаборатории. Однако его применение иногда может привести к ошибочным результатам. Возникающие при этом проблемы в значительной степени решены в работе Норриса и Поуэлла [42], но широкое использование подхода этих авторов ограничено требованием специальной техники и оборудования.

Основная трудность прямого микроскопического подсчета связана с воспроизводимостью процесса^аполнения камеры жидкостью [42]. В предлагаемом ниже методе толщину жидкости в камере измеряют с помощью хорошего микроскопа, фокусируя объектив на бактериях, находящихся на верхней и нижней поверхностях жидкости. Расстояние между ними измеряют с помощью микрометрической шкалы микроскопа. Горизонтальные размеры между двумя отметками в имеющихся в продаже камерах довольно точны [42], и поэтому здесь не возникает проблем.

Второй трудностью является адсорбция бактерий на поверхности стекла, в частности пипеток. Эту адсорбцию можно снизить, если для разведений вместо воды использовать раствор с высокой ионной силой. Другой способ заключается в использовании раствора формальдегида (нейтрализованного К2НРО4) со следами анионного детергента [42]. Преимуществом формальдегида является его способность подавлять рост и подвижность бактерий, а смеси К2НРО4 с детергентом — ее способность препятствовать агрегации. Однако детергент даже в очень низких концентрациях может лизировать некоторые микроорганизмы. Адсорбцию клеток можно уменьшить, если использовать пластмассовые сосуды и пластмассовые наконечники пипеток. В описываемой ниже процедуре отбираемые пробы разводят 0,1 н. НС1. Пипеткой с пластмассовым наконечником их быстро переносят в стеклянную счетную камеру, где клетки прикрепляются к поверхностям камеры.

Счетная камера Хауксли (А 70 Helber; Hawksley, Ltd., Lancing, England) лучше камеры Петрова-Хаузера (Arthur Н. Thomas Co., Philadelphia, Pa.), поскольку ее оптическая толщина с обычным покровным стеклом достаточно мала, чтобы ее можно было просматривать с масляной иммерсией. Хотя большинство подсчетов проводят в безыммерсионных системах, иногда из-за большого числа клеток или из-за их способности образовывать скопления необходимо использовать масляную иммерсию. Камера Хауксли представляет собой пластинку, имеющую круглую выемку глубиной 20 мкм, на дне которой нанесены метки, ограничивающие зону 50Х 50 мкм.

Основным преимуществом микроскопического метода подсчета является возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта. Наблюдение с масляной иммерсией делает подсчет более утомительным, однако в этом случае лучше различаются индивидуальные клетки. Другие рекомендации можно найти в инструкциях фирм — изготовителей счетных камер, а также в лабораторных пособиях для микробиологов. Обсуждение методов разведения и статистической обработки результатов приведено в разд. 11.5 и в ряде работ [5, 46].

Методика

1. Камеру и покровное стекло промывают водой с небольшим количеством анионного детергента, а затем споласкивают водой и спиртом, промокают и сушат на воздухе.

2. Предварительно определяют концентрацию клеток. Если эта концентрация ниже 3-Ю8 клеток в 1 мл, то приступают к следующему этапу. Если она выше, то предварительно разводят клеточную суспензию раствором Норриса — Пауэлла, приготовленным следующим образом. К 1 л воды добавляют 5 мл формалина (40%-ного формальдегида) и доводят рН (можно по индикаторной бумаге) до 7,2—7,4 с помощью твердого Na2HP04. Количество добавляемого фосфата зависит от содержания в формалине муравьиной кислоты. На кончике шпателя добавляют столько додецилсульфата натрия, сколько необходимо для прекращения быстрого ло-пания пузырьков, образующихся при продувании воздуха через раствор с помощью пастеровской пипетки.

3. К пробе добавляют равное количество 0,1 н. НС1. Это приводит к гибели бактерий и появлению на их поверхности положительного заряда, благодаря чему они перестают агрегировать, но начинают адсорбироваться на стекле.

4. Немедленно с помощью автоматической пипетки с пластмассовым наконечником (Pipetteman, Eppendorf, Centaur) в камеру Хауксли вносят около 5 мкл суспензии, переворачивают камеру на 1—2 мин, затем возвращают ее в нормальное положение и оставляют на 3— 5 мин.

5. Рассматривают содержимое камеры в микроскоп, используя фазово-контрастный объектив (лучше с масляной иммерсией). Большинство клеток прикрепляется к нижней поверхности камеры, часть -— к верхней, а остальные свободно движутся в камере (броуновское движение).

6. Фокусируют объектив на клетки, прикрепленные к дну камеры, и отмечают показания на микровинте (у хороших микроскопов шкала микровинта откалибрована в микрометрах). Затем фокусируют объектив на клетки, прикрепленные к верхней поверхности камеры, снимают показания и прибавляют величину диаметра бактерий. Таким способом можно определить толщину камеры, которая обычно равна 20 мкм. В целях освоения метода тщательно измеряют толщину камеры в различных ее участках, чтобы убедиться в том, что она заполнена равномерно.

Общее число подсчитанных клеток»Фактор разведения*4-108 Число подсчитанных малых квадратов*Толщина камеры (мкм)*

Если точно расположить покровное стекло, то объем раствора над малым квадратом равен 50-50-20 мкм3= = 5-104 мкм3 = 5-10~8 мл. Обратная этому числу цифра 2- 107/мл представляет собой обычный фактор в формуле, предлагаемой в инструкциях фирм — изготовителей камер. Приводимая выше формула уменьшается до этой величины, если толщина камеры равна 20 мкм. Чтобы процедура оказалась успешной, необходимо, чтобы при измерении толщины камеры к каждой поверхности было прикреплено по крайней мере несколько клеток. Удобнее, однако, производить подсчет, когда основная масса клеток прикреплена к одной поверхности. Для завершения счета в малом квадрате следует сфокусировать объектив на свободных клетках, а затем на поверхности раздела, где расположено меньшее число клеток. Подсчитав об7. Подсчитывают число клеток в каждом малом квадрате. В оптимальном случае оно должно составлять 5—15. Клетки, расположенные по краям квадрата, учитывают лишь в том случае, зсли они находятся на верхней или правой стороне. Для подсчета клеток внутри квадрата используют один регистр механического счетчика; второй регистр используют для подсчета количества квадратов. Некоторые исследователи пользуются счетчиком только для подсчета десятков, в уме подсчитывая однозначные числа. Для точного определения подсчитывают не менее 600 клеток, причем это необходимо делать при нескольких заполнениях камеры. Ряд авторов рекомендует вести подсчет при многократном заполнении камеры, с тем чтобы усреднять получаемые при этом результаты. При использовании описываемого здесь метода в этом нет необходимости, поскольку каждый раз измеряется толщина заполненного пространства камеры.

страница 82
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.05.2017)