Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

ьтура будет оставаться в этом состоянии бесконечно долго (если не изменится в результате мутаций или селекции). Однако это только теория. Практически невозможно измерить все параметры культуры, даже если она поддерживается в состоянии непрерывного разведения. Однако если использовать менее жесткие критерии, то культуры, находящиеся в состоянии сбалансированного роста, изучать довольно просто.

Рассмотрим культуру в состоянии сбалансированного роста. Обозначим какое-нибудь экстенсивное свойство, например биомассу, ДНК, РНК или площадь поверхности клеток в пересчете на миллилитр культуры, буквой X. Скорость увеличения X пропорциональна количеству биомассы, и, следовательно,

где X — коэффициент пропорциональности. После интегрирования и подстановки граничных условий (Х=Х0, когда t = 0) получаем

Иными словами, для каждого вещества увеличение X происходит экспоненциально во времени. Если соотношение между двумя веществами остается постоянным, тот же самый коэффициент пропорциональности следует использовать при любом выборе параметра X. Коэффициент К называют удельной скоростью роста. Экспоненциальное увеличение в соответствии с одной и той же удельной скоростью роста характерно не только для любого вещества, обозначенного X, но и для любой комбинации веществ или скорости обмена любого вещества. Это позволяет использовать в качестве показателя роста потребление кислорода или образование метаболита.

Такие интенсивные свойства, как % и отношение концентраций различных субстратов в условиях сбалансированного роста, остаются постоянными. Кроме того, остается постоянным распределение клеток по размерам. При этом в нормальной клетке все внутриклеточные процессы идут с постоянными скоростями, остается также постоянной способность каждой вновь образованной дочерней клетки к образованию колонии (т. е. не изменяется доля нежизнеспособных клеток). Поэтому в данные специфических условиях независимо от способа измере ния роста (подсчет частиц, образование колоний или хи мическое определение клеточных компонентов) получают одинаковую удельную скорость роста, которая не меняется со временем.

В принципе такие «идеальные» условия можно создать лишь при непрерывном культивировании в проточном режиме. Сбалансированный рост достигается за счет роста, ограниченного скоростью добавления питательных компонентов в условиях хемостата, а также за счет неограниченного роста в условиях турбидостата, где культура механически разбавляется для сохранения постоянного количества биомассы в единице объема среды. Сбалансированный рост бактерий получают также при повторяющемся разбавлении периодической культуры [39, 49].

Изменения в клетках при различных скоростях роста

Организмы отвечают на изменения химических и физических условий среды изменением собственного состава. Эти изменения четко продемонстрированы для некоторых энтеробактерий [31, 39], но они характерны вообще для всех прокариот. В принципе благоприятные условия способствуют быстрому росту, который требует более высоких концентраций рибосом и связанных с ними белков. В терминах состава клеток это означает более высокое содержание РНК. Кроме того, при благоприятных условиях роста клетки могут накапливать резервный материал, например гликоген и поли-р-оксимас-ляную кислоту, а также увеличиваться в размерах. Как предполагают, последнее связано с тем, что клетки в таких условиях не нуждаются в увеличении относительной поверхности, облегчающем использование субстратов в разбавленных средах. Из-за изменений в составе клеток при измерении роста по содержанию клеточных компонентов возможны ошибки. Строго говоря, подобные измерения можно проводить лишь при росте в одной и той же среде и при условии, что сами бактерии не изменяют ее состав.

Несбалансированный рост

В ходе развития стационарных культур, в особенности при разведении таких культур свежей средой, происходят значительные изменения свойств микроорганизмов. Как уже упоминалось, это было продемонстрировано для некоторых энтеробактерий [1, 11], но, вероятно, относится и ко всем прокариотам. В некотором смысле стадии развития стационарной культуры являются артефактом, зависящим от состава среды, а также возраста и состояния клеток инокулята; однако во всех случаях эти стадии существенны при измерениях роста. Феномены, проявляющиеся на различных стадиях развития стационарной культуры, важны в экологических исследованиях, где особую роль играют условия окружающей среды, которые в значительной степени неконтролируемы. Ответ культуры на колебания естественных условий включает в себя также изменения клеточных характеристик [31, 34]. Так, например, при разведении стационарной культуры, растущей в богатой среде, происходит ускорение макромолекулярного синтеза. Вначале синтезируются компоненты системы биосинтеза белка — рибосомные белки и рибосомная РНК, И только после завершения синтеза ряда макромолекул происходит клеточное деление. В этой фазе значительно возрастает средний размер клеток. Когда среда уже не способна поддерживать быстрый рост бактерий, интенсивность клеточных процессов замедляется, что приводит к образованию мелких клеток с недостаточным содержанием РНК. Наконец, часть бактерий гибнет, т. е. происходит уменьшение числа колониеобразующих единиц [16]

Вероятно, большинство исследователей, предполагающих применять приведенные в этом руководстве методы, будут вызывать изменения роста преднамеренно. Такие изменения можно вызвать колебаниями в содержании или недостатком питательных компонентов в среде, добавлением ингибиторов роста (особенно антибиотиков), ионизирующим излучением и другими экстремальными физическими факторами, например высокой или низкой температурой и осмотическим давлением. Поскольку влияние перечисленных факторов на рост может быть довольно сложным, при интерпретации результатов нужно быть очень осторожными.

Источники ошибок

Существуют четыре вида источников ошибок. Первый и наиболее опасный из них заключается в том, что бактерии, которые обычно делятся регулярно, в условиях слабой токсичности способны расти с образованием скоплений и нитей. Второй опасный момент связан с различной степенью жизнеспособности поврежденных бактерий при различных условиях культивирования. Восстановлению жизнеспособности бактерий способствуют процессы репарации, но они протекают лишь в определенных условиях [8]. Третий источник ошибок связан с возможным образованием резистентных форм. Учет бактерий, способных к образованию спор, не составляет проблемы, поскольку известны методы контроля и измерения, позволяющие вносить соответствующие поправки. В том случае, когда споры в растущих спорообразующих культурах не появляются, возможны ошибки при измерении роста. Четвертый источник ошибок имеет отношение к процедурам, с помощью которых инокулят вводят в новую среду. Результаты зависят от того, как увеличивается при введении концентрация инокулята — постепенно или ступенчато, насколько долго инокулят присутствует в высокой концентрации и как она потом изменяется. Во время угрожающих популяциям изменений среды клеточная концентрация может быть критической. Для защиты от токсического действия факторов среды бактерии имеют индуцибельные или какие-либо другие, пока неизвестные системы. Эффективность защиты зависит от численности микроорганизмов, осуществляющих детоксикацию в результате совместной деятельности. Защиту против медленно проникающих токсичных веществ способен обеспечивать сам по себе быстрый рост клеток.

Все вышеперечисленные взаимоотношения можно проиллюстрировать на примере взаимодействия рифам-пина с клетками Е. coli [36]. В достаточной концентрации клетки способны инактивировать рифампин в определенных дозах; после их обработки антибиотиком в постепенно нарастающих концентрациях культуры становятся толерантными к повышенным дозам препарата. Независимо от этого быстро растущие бактерии более устойчивы к антибиотику, чем медленно растущие. Возможно, это объясняется тем, что препарат не успевает эффективно проникать в быстро растущие клетки. Например, если антибиотик добавляется в относительно высокой концентрации, а затем разводится до низкой, то происходит подавление роста в условиях, при которых обычно низкие концентрации не оказывают ингиби-рующего действия. После того как в результате кратковременной обработки культуры высокими дозами антибиотика рост замедляется, ингибирование остается постоянным, поскольку препарат успевает проникать в клетку и в этих условиях процесс ингибирования вызывается и низкими дозами антибиотика.

Мщелиальный тип роста

Изучать рост микроорганизмов, имеющих мицелий, сложнее, чем рост более «удобных» микроорганизмов, клетки которых бинарно делятся и затем немедленно расходятся. Проблемы и методы изучения роста колоний уже обсуждались Кэлэмом [12] и Кохом [33], поэтому мы рассмотрим их здесь очень кратко. Фильтровать и взвешивать высушенный или влажный мицелий удобнее, нежели мелкие немицелиальные клетки. Кроме того, довольно легко регистрировать увеличение размеров ми-целиальной колонии. Например, для измерения роста можно использовать очень длинную стеклянную трубку, содержащую слой питательного агара. После инокуляции на одном конце трубки мицелий начинает расти вдоль трубки, и если ее соединить еще с одной, то он может «перерасти» в следующую и т. д. [47] При этом колонии растут в одном измерении, тогда как на поверхности агара они растут в двух измерениях, а во встряхиваемых культурах — в трех.

Скорость увеличения размера колонии в одном, двух или трех измерениях зависит от скорости удлинения концевых гиф, которые иногда растут перпендикулярно поверхности колонии, тогда как использование растущей массой мицелия питательных компонентов зависит от площади поверхности колонии. В случае встряхиваемой культуры на характер роста накладывает отпечаток природа и величина фрагментов инокулята; для крупных фрагментов рост ограничивается уже на ранней стадии за счет медленной диффузии питательных компонентов в мицелиальную массу. Следовательно, основная сложность заключается в том,

страница 81
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.04.2017)