Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

сти роста выход клеток составляет примерно 10±2 г сухой биомассы на 1 моль синтезируемого АТР.

Однако выход биомассы в пересчете на 1 моль АТР довольно широко варьирует для разных бактерий, если рост не лимитируется энергетическим субстратом, а скорость роста культуры значительно ниже максимальной. Источники углерода и энергии могут использоваться не только для роста клеток, но и для образования продукта. Кроме того, энергетические субстраты расходуются на поддержание жизнеспособности клеток. Поскольку клетки могут использовать энергетические субстраты для дыхания в отсутствие роста, энергетические затраты на поддержание жизнеспособности бактерий будут вносить свой вклад в потребление этих субстратов без сопутствующего увеличения биомассы. Эндогенный метаболизм практически не оказывает влияния на расчеты выхода клеток, если скорость роста культуры близка к максимальной и энергетический субстрат является лимитирующим питательным компонентом. Однако потребление энергетических субстратов для поддержания жизнеспособности клеток может значительно возрасти при скоростях роста ниже максимальной или в экстремальных биофизических условиях среды. Поскольку надежные расчеты выхода биомассы требуют осторожного и тщательного контроля условий культивирования, лучше всего их проводить для хемостатных систем. Именно в этих условиях лимитирующий рост субстрат и удельная скорость роста и. могут регулироваться.

Расчет общего выхода биомассы на основании данных, полученных в проточной культуре, предполагает, что концентрации субстрата и клеток находятся в состоянии равновесия. Поэтому легче всего такой расчет провести для культуры, выращиваемой в хемостате. В хемостатной среде скорость роста бактерий лимитируется только одним питательным компонентом. Все остальные питательные компоненты добавляются в избытке. Для составления такой среды следует провести элементный анализ бактерий, которые будут культивироваться в хемостате. В среду добавляют все компоненты клетки, обнаруженные при таком анализе. В конечном счете рост определяется концентрацией лимитирующего питательного компонента. Поскольку концентрация клеток в хемостате регулируется автоматически в соответствии со скоростью добавления к среде лимитирующего питательного компонента, более важно отношение компонентов среды, а не их абсолютные количества. Поэтому для определения общего выхода биомассы среду следует составлять так, чтобы отношение элементов, поставляемых в среду, к элементам, являющимся лимитирующими, было значительно выше, чем отношение, вычисленное на основании данных элементного анализа.

Приводимые ниже расчеты основаны на том, что в отношении концентрации клеток и концентрации субстрата система находится в состоянии равновесия. За этим следят в течение периода времени, достаточного для замены одного объема среды в ферментере. Если условия культивирования начинают изменяться (увеличивается или уменьшается скорость подачи среды в хемостат), то оператор должен иметь достаточно времени для возвращения культуры в состояние равновесия. Этого достигают путем смены не менее четырех объемов жидкости в ферментере. Поскольку проточный ферментер работает по принципу разбавления, ступенчатое или импульсное изменение условий работы ферментера может вызвать отклонения от существующего состояния равновесия. В результате система будет стремиться к новому состоянию равновесия со скоростью, определяемой скоростью разбавления культуры. Иными словами, для завершения перехода культуры к новому равновесному состоянию необходимы четыре цикла. Например, 2-литровый хемостат, в котором скорость поступления и удаления среды равна 0,5 л/ч, работает со скоростью разбавления F/V=D = 0,25 ч~К Время, необходимое для четырех обновлений объема среды, рассчитывается путем деления 4 на скорость разбавления. В данном случае объем среды в ферментере будет полностью обновлен 4 раза за 16 ч (4/0,25 ч-1), т. е. после изменения условий роста проточной культуры и до установления нового равновесия должно пройти не менее 16 ч.

В действительности время, необходимое для достижения нового состояния равновесия, может зависеть от способа изменений условий культивирования. Если такие изменения заключаются, например, в ступенчатом снижении поступления питательных компонентов, то достаточно четырех циклов. Если же эти изменения включают в себя увеличение поступления питательных компонентов в условиях быстрого роста культуры, то для достижения нового равновесия будет необходимо более четырех циклов. В этом случае для быстрорастущих клеток могут понадобиться новые ферменты, осуществляющие метаболизм добавляемых питательных компонентов.

После достижения состояния равновесия при проточном культивировании общий выход биомассы можно определить следующим образом:

у (X — Х0) Сухой вес клеток, г

x/s /$о — Поглощенный субстрат, г '

где X — сухой вес клеток (в граммах) на 1 л вытекае-мой из ферментера среды, Хо — сухой вес клеток (в граммах) на 1 л среды, подаваемой в ферментер (обычно нуль), S — вес субстрата (в граммах) на 1 л вытекаемой среды и S0 — вес субстрата (в граммах) на 1 л среды, подаваемой в ферментер. Если в ферментер подается стерильная среда, то величина Хо равна нулю и выход становится равным YX/S = X/ (S0—S).

Для определения сухого веса клеток путем количественного фильтрования через предварительно взвешенный мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм пропускают тщательно отмеренный объем культуры из ферментера. Клеточный осадок на фильтре отмывают буфером или дистиллированной водой, чтобы удалить остатки среды. Мембранный фильтр высушивают до достоянного веса в термостате с температурой не выше 105 °С.

Чтобы избежать излишнего подсушивания клеток, которое приводит к потере веса, температуру термостата можно снизить. Предостережение: многие фильтры после отмывки и высушивания теряют свой вес. Поэтому следует всегда фильтровать и взвешивать несколько проб, а также промывать и взвешивать несколько фильтров в качестве контроля. Более точный метод заключается в центрифугировании и отмывке клеток, как описано выше (разд. 10.4.2). При этом отбирают большие объемы среды, ресуспендируют клетки в небольшом объеме воды, высушивают и взвешивают (разд. 25.2.2).

Общий выход биомассы связан с потребностями в лимитирующих субстратах для поддержания жизнеспособности клеток и их роста, причем субстраты выступают в роли источника энергии согласно следующему уравнению:

1 m - 1

где и.— удельная скорость роста (ч~!), m — удельная скорость потребления субстрата для поддержания жизнеспособности клеток (ч-1), Yx/S — общий выход клеток и KG— удельный выход роста. Величины m и YG можно определить, построив на миллиметровой бумаге график зависимости l/Yx,/s от 1/и. (напомним, что для простой проточной культуры без рециклизации клеток \i = D). Если данная зависимость имеет вид прямой линии, то эта линия пересекает ось ординат в точке 1/Ус, а ее наклон соответствует величине т.

Хотя выход биомассы удобно выражать в виде биомассы в пересчете на массу или количество молей использованного субстрата, при этом иногда возможна путаница. Херберт [30] предложил выражать выход биомассы в грамм-атомах углерода выросших клеток в пересчете на грамм-атомы элемента, поглощенного из лимитирующего субстрата. Принятие этого определения поможет стандартизировать приводимые в литературе методы и устранить большую часть неясностей при интерпретации полученных данных. При выражении интенсивности роста в грамм-атомах углерода образованных клеток нет необходимости определять их полный эле10 ЖИДКАЯ КУЛЬТУР/

ментный состав; достаточно только определить содержание углерода. В табл. 10.5 суммированы термины, используемые при расчетах выхода биомассы.

10.6. ФИРМЫ-ИЗГОТОВИТЕЛИ

1. Aaron Equipment Co., Div. Areco Inc., 9301 W. Bernice St., Schiller Park, IL 60176

2. Air Resources, Inc., 800 E. Northwest Highway, Palatine, IL 60067

3. Alloy Crafts Co., Subsidiary of Lox Equipment Co., RR Box 2C-A, Delphi, IN 46923

4. Artisan Industries, Inc., 73 Pond St., Waltham, MA 02154

5. B. Braun Melsungen AG, P.O.B. 346, D-3508 Melsungen, West Germany

6. Beckman Instruments, Inc., 2500 Harbor Blvd., Fullerton, CA 92634

7. Bellco Glass, Inc., 340 Edrudo Rd., Vineland, NJ 08360

8. Brighton Corp., 11861 Mosteller Rd., Cincinnati, OH 45241

9. Chemapec, Inc., 230-C Crossway Park Dr., Woodbury, NY 11797

10. Chemineer Agitators, P. O. Box 1123, Dayton, OH 45401

11. Cole-Palmer Instrument Co., 7425 N, Oak Park Ave., Chicago, IL 60648

12. Crepaco, Inc., 8303 W. Higgins Rd., Chicago, IL 60631

13. Dollinger Corp., P. O. Box 23200, Rochester, NY 14692

14. Dow Corning Corp., P. O. Box 1767, Midland, MI 48640

15. DuPont Co., Instrument Products, Scientific and Process Div., Concord Plaza, Quillen Bldg., Wilmington, DE 19898

16. Fisher Scientific Co., 711 Forbes Ave., Pittsburgh, PA 15219

17. Gelman Sciences, Inc., 600 S. Wagner Rd., Ann Arbor, MI 48106

18. General Electric Co. (Silicone Products Dept.), Waterford, NY 12188

19. Glitsch Inc., 4900 Singleton Blvd., P. O. Box 226227, Dallas, TX 75266

20. Infrared Industries, Inc., Box 989, Santa Barbara, CA 93102

21. Koch Engineering Co., Inc., 4111 S. 37 St. N, Wichita, KS 6/220

22. Leeds and Northrup Co., Sumneytown Pike, North Wales, PA 19454

23. LKB Instruments, Inc., 1221 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852

24. The London Co., 811 Sharon Dr., Cleveland, OH 44145

25. Manostat Corp., 519 Eighth Ave., New York, NY 10018

26. L. E. Marubushi, Co., Ltd., Koki Bldg., 8—7 2-Chome, Kaji-cho, Chiyoda, Tokyo, Japan

27. Michigan Dynamics, Division of AMBAC Industries Inc., 32400 Ford Rd., Garden City, MI 48135

28. Millipore Corp., Ashby Rd., Bedford, MA 01730

29. Mine Safety Appliances Co., 600 Penn Center Blvd., Pittsburgh, PA 15235

30. Mixing Equipment Co., Inc., Unit of General Signal, 177 Mt. Read Blvd., Rochester, NY 14603

31. New Brunswick Scientific Co., Inc., 44 Talmadge Rd., P. O. Box 986, Edison, NJ 08811

страница 79
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.04.2017)