ы мембраны, диаметр которых изменяется в очень узких пределах. На практике при мембранной фильтрации требуется дополнительное давление на фильтр. Аппараты для мембранной фильтрации и мембранные фильтры с различными размерами пор имеются в продаже (Millipore Corp., Nucleopore Corp., Gelman Sciences, Inc.).

Выбор мембраны зависит от характеристик культуры и от того, что необходимо получить — клетки или фильтрат. Поскольку средний размер клеток бактерий равен приблизительно 0,5—1,5 мкм, для их полного удаления в случае стерилизации фильтрованием требуется микропористый мембранный фильтр с размером пор менее 0,5 мкм. Для стерилизации фильтрованием часто используют мембраны с диаметром пор 0,22±0,02 мкм. Такие мембраны подходят для большинства методов стерилизации, но из-за того, что бактерии обладают достаточной гибкостью, теоретически можно допустить, чтс они способны проходить через них. Поэтому растворы, стерилизованные фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, следует периодически проверять на стерильность.

Использование мелкопористых мембранных фильтров со средним размером пор 0,45 ±0,04 мкм в принципе позволяет быстро и эффективно фильтровать бактериальные культуры, но не обеспечивает стерильности фильтрата. Сами мембранные фильтры и аппарат для стерилизации фильтрованием должны стерилизоваться автоклавированием или каким-либо другим способом. Собирать бактериальные клетки и готовить стерильные растворы путем фильтрования лучше всего под давлением азота. Такая фильтрация значительно снижает или полностью препятствует окислению фильтруемого вещества благодаря положительному давлению инертного газа в фильтрующем устройстве. Если необходимо собирать клетки в стерильных условиях, то азот следует предварительно простерилизовать фильтрованием. Все консультации по вопросам рабочего давления и размера используемого оборудования следует получить у фирмы-изготовителя.

Дополнительные сведения по осадочной и мембранной фильтрации можно найти в работах [47, 58, 60].

10.4.2. Центрифугирование

Сбор бактериальных клеток путем центрифугирования обычно приводит к менее полному их отделению от культуральной среды, чем с помощью фильтрации. Однако этот метод позволяет получить культуральную среду и клетки, свободные от загрязнения посторонними веществами, например фильтрующим материалом; поэтому он широко используется для получения биомассы в лабораторных условиях. Но для приготовления стерильных растворов центрифугирование не пригодно.

Скорость осаждения клеток в процессе центрифугирования зависит от таких факторов, как вязкость среды, размер (диаметр) частиц и разница в плотности между клетками и суспендирующей средой. Все эти факторы определяют время и скорость центрифугирования в каждом конкретном случае. Для осаждения большинства бактерий из относительно невязких сред (таких, как питательный бульон) вполне достаточно центрифугирования при 10 ООО g в течение 10—15 мин. Поскольку упаковка бактерий в осадке зависит от их размера и условий культивирования, при подборе скорости или времени центрифугирования необходимо руководствоваться тем, чтобы осадок при сливании надосадочной жидкости как можно меньше подвергался ресуспендированию.

Оборудование для центрифугирования

Лабораторные центрифуги работают как в периодическом, так и в проточном режиме, причем иногда оба вида операций можно выполнять в одной центрифуге. Существуют роторы самых разных типов, но все они работают по одному общему принципу — регулируемого приложения центробежной силы во вращающемся роторе. Поскольку средний диаметр частиц в бактериальной культуре довольно мал, для разделения клеток и среды с помощью центрифугирования обычно необходимы высокие скорости вращения. При высокоскоростном центрифугировании образуется большое количество тепла, поэтому центрифуги должны быть оснащены собственной охлаждающей системой. Если такой системы нет, то работу необходимо проводить в холодной комнате. Кроме того, поскольку центрифужные роторы выпускаются различных размеров, при работе с ними следует исходить не из скорости и времени центрифугирования, а из величины центробежной силы (обычно выражаемой в единицах g) и времени центрифугирования. Фирмы — изготовители центрифуг — DuPont Instruments, Ivan Sor-val, Inc., International Equipment Co., Beckman Instruments, Inc. — публикуют табличные данные о скоростях вращения роторов и эквивалентных им величинах центробежных сил.

При работе с большими объемами культуральной среды используют проточное центрифугирование (сепараторные центрифуги). Центрифуги с охлаждением фирмы DuPont — Sorval оборудованы специальным ротором и системой подачи среды для работы в проточном режиме. Этот метод пригоден для выделения большинства бактерий, кроме хлопьеобразующих видов и грибов, обычно забивающих пути подачи среды.

Центрифуги типа Sharpies оборудованы длинными и узкими роторами, через которые культура подается снизу вверх. При высокой скорости вращения таких роторов клетки оседают на их стенках. Данный способ центрифугирования дает возможность очень быстро получать большие количества клеток, а также проводить дифференциальное центрифугирование частиц различного размера или плотности. Существуют модели цент рифуг как с ограниченной емкостью для биомассы, так и с непрерывным удалением осадка клеток.

Методика центрифугирования

Ниже описана методика центрифугирования, позволяющая получать отмытые клетки в стерильных условиях. Если стерильность не требуется, то метод можно упростить.

1. Прежде всего готовят соответствующее количество раствора для промывания клеток, получаемых после центрифугирования (разд. 25.1). Объем раствора должен быть в 4—б раз больше объема культуры, а значения ионной силы и рН промывающего раствора и ростовой среды должны быть очень близки. Перед использованием раствор стерилизуют и охлаждают до 0—4°С.

2. Используемый в работе центрифужный ротор охлаждают в холодильнике. Предостережение: нельзя помещать ротор, имеющий комнатную температуру, на ось

центрифуги, а затем охлаждать его с помощью центрифужной системы охлаждения. При этом ротор может

сжаться и настолько плотно закрепиться на оси, что

впоследствии возникнут сложности при его снятии.

3. Стерилизуют несколько центрифужных пробирок с крышками (полипропиленовые и поликарбонатные пробирки можно автоклавировать) и дают им остыть. Для сохранения стерильности пробирки при ее последующем использовании перед автоклавироваиием крышку и верхнюю часть пробирки обертывают алюминиевой фольгой.

4. Определяют объем центрифужных пробирок и с соблюдением правил асептики заполняют их на 2/з бактериальной культурой. Пробирки попарно уравновешивают. Если окажется непарная пробирка, ее уравновешивают с пробиркой, заполненной дистиллированной водой. Все пробирки надежно закрывают стерильными крышками.

5. Помещают попарно уравновешенные пробирки в ротор друг против друга.

6. Проводят центрифугирование в соответствующих условиях согласно инструкции фирмы-изготовителя. Большинство бактерий осаждаются при центрифугировании в течение 10—15 мин при 10 ООО g. Некоторые центрифужные системы имеют специальное приспособление, ограничивающее вибрацию ротора при его вращении с малыми скоростями (при остановке). Если такое приспособление отсутствует, не исключена опасность взбалтывания осадка.

7. Пробирки вынимают осторожно из ротора и отмечают положение бактериального осадка. Надосадочную жидкость в стерильных условиях декантируют или переносят пипеткой в стерильный сосуд. При этом практически невозможно не вызвать частичного ресуспендирова-ния бактериального осадка. Чтобы бактерии не попадали в сос\д, приходится оставлять часть надосадочной жидкости в пробирке.

8. Каждую пробирку с бактериальным осадком с соблюдением правил асептики заполняют на 2/з объема стерильным холодным раствором для промывания. Осадок бактерий суспендируют в этом растворе с помощью миксера типа Vortex. Этапы 4—6 повторяют не менее 4 раз, меняя раствор для промывания.

9. После завершения промывки надосадочную жидкость удаляют с соблюдением правил асептики и осадок суспендируют в небольшом количестве стерильной среды. Полученную суспензию используют в дальнейших исследованиях.

Число отмывок при фильтрации или центрифугировании зависит от условий культивирования, объема раствора для промывания и объема сырой биомассы. Если сырая биомасса занимает около 1/10 объема всей куль-туральной суспензии, то 4-кратной промывкой объемами раствора, равными исходному объему культуры, удаляется до 99,99% всех растворимых примесей. Несколько промывок нельзя заменить одной, объем которой равнялся бы суммарному объему всех промывок, поскольку каждая последующая промывка снижает уровень примесей почти в 10 раз.

10.5. РАСЧЕТЫ ВЫХОДА БИОМАССЫ

При расчете выхода биомассы исходят из материального баланса устойчивой системы культивирования. Моно определил константу выхода, или экономический коэффициент (У), следующим образом:

у Образованные клетки, г

Использованный субстрат, г

Выход биомассы в расчете на использованный субстрат часто обозначают как Yx/S, где в индексе указано отношение соответствующих концентраций. Широко принято использование соотношения масс для выражения выхода клеток на основании потребления углеродного субстрата [10, 42]. Выход можно довольно легко рассчитать, определив продукцию сухой биомассы за определенный период культивирования по отношению к массе использованного в этот же период углеродного субстрата. Если выход биомассы хотят отнести к потреблению кислорода или образованию АТР, синтезируемого в процессе роста, то его определяют следующим образом:

У Сухой вес клеток, г

к/АТР — Образованный АТР, моль •

у Сухой вес клеток, г

я/Ог Поглощенный кислород, моль

При различных условиях и для многих микроорганизмов выход клеток, рассчитанный по отношению к образовавшемуся АТР или поглощенному кислороду, отличается постоянством. Например, в условиях лимитирования энергетическим субстратом и довольно быстрой скоро