Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

.9).

В устройстве, основную часть которого составляет стеклянная трубка из пирекса с загнутыми краями (рис. 10.10), сочетаются преимущества встряхиваемых колб (разд. 10.1.2) и диализной культуры. В подобных устройствах [51] можно использовать любые типы листовых мембран.

Рис. 10.10. Сосуд для диализной культуры, оборудованный удерживающим устройством для крепления на круговой качалке. Нижняя часть сосуда заполнена стерильной средой, которая перемешивается вращающимся шариком. В верхней части находится культура, которая турбулентно аэрируется за счет перемешивания в присутствии отбойника [25].

При осуществлении культивирования с диализом в лабораторных или производственных масштабах целесообразно выращивать бактерии в отдельной замкнутой системе, которая соединялась бы с диализной замкнутой системой промежуточным диализатором [22]. Такое устройство «диализатор—диализная культура», схематически представленное на рис. 10.11, может работать в периодическом режиме в обеих замкнутых системах

С о

с

чл о

со

А

со

F S

F T S X

Рис 10.11. Схемы четырех моделей диализного культивирования. Принципы изображенной системы диализатор—диализная культура пригодны для многих целей. Обозначения- F — скорость потока, 5 — концентрация субстрата, V—объем, X—концентрация клеток, поступающих в резервуар и ферментер, а также их концентрация в этих сосудах и в вытекающей из них среде. Воспроизводится с некоторыми изменениями из работы [51] А. Резервуар и ферментер для периодического культивирования. Б. Резервуар и ферментер для непрерывного культивирования. В. Резервуар для периодического культивирования и ферментер для непрерывного культивирования. Г. Резервуар для непрерывного культивирования и ферментер для периодического культивирования.

(рис. 10.11, Л), в непрерывном режиме в обеих системах (рис. 10.11,5) или в двух комбинациях этих режимов (рис. 10.11, В, Г).

Основным условием эффективной работы таких систем является подходящее устройство для диализа. Такое устройство, напоминающее рамный фильтр-пресс, содержит сепараторы из силиконовой резины, которые способствуют созданию турбулентных потоков культуры и диализата по разные стороны от мембран [51]. Для этих целей используют также различные типы гемодьализа-торов.

Готовую систему можно приспособить к используемой культуре. Так, при лимитировании роста бактерий токсичными метаболитами (например, молочной кислотой) наиболее эффективно работает полностью проточная система (рис. 10.12). Непосредственно в ферментер субстрат (S°f) подают в довольно высокой концентрации, и поэтому потребность в обычном сосуде для диализата отпадает. Диализная система в данном случае состоит только из шлангов, насоса и диализной части диализатора и имеет относительно небольшой объем (Vd). В систему поступает только вода с довольно высокой скоростью (Fd). Такая система обеспечивает максимально возможный для диализа концентрационный градиент. Стайбер и др. [54] применили ее в своей работе и показали максимальное превращение концентрированной (25%) лактозы в молочную кислоту.

Математическое моделирование и применение ЭВМ

На примере описанных выше систем и практического использования проточного культивирования с диализом мы обсудим значение математического моделирования и расчетов на ЭВМ для предсказания результатов, которые можно получить при культивировании бактерий. Для подтверждения теоретических предсказаний прово

дят лабораторные опыты, изменяя лишь некоторые экспериментальные условия в заранее выбранных критических точках. В свою очередь экспериментальные результаты используются для установления констант роста и для того, чтобы подтвердить необходимость в дополнительных членах в уравнениях. Основываясь на успешных теоретических предсказаниях и экспериментальных подтверждениях, модель становится значительно более точной и может быть полезна при управлении процессом культивирования.

Примером такого сочетания теоретического и экспериментального подхода к бактериальному процессу могут служить данные Стайбера и др. [15, 54, 55], полученные при культивировании бактерий в среде с лактатом и аммонием. Для субстрата, продукта и биомассы в ферментере и диализной замкнутой системе были выведены уравнения материального баланса и скоростей соотношения реакций. Эти уравнения объединили, определили в них переменные в безразмерной форме, а производные по времени приравняли к нулю, чтобы получить общее решение для состояния равновесия, которое описывается пятью квадратными уравнениями. Реальные величины для варьируемых членов были введены в программу для вычислительной машины. При сравнении смоделированных предсказаний с экспериментальными данными (рис. 10.13) была получена хорошая корреляция.

Такая методология, сочетающая теоретические предсказания и экспериментальные подтверждения, широко используется в промышленных микробиологических процессах, но в других областях бактериологии она почти не применяется. Этот важный метод следует значительно более широко применять в научных исследованиях, например для предсказания исхода инфекционных заболеваний.

10.3.5. Ферментеры с иммобилизованными клетками (Ф. Герхардт)

Большинство методов бактериальных культур предназначено для максимального размножения клеток, и основная масса питательных компонентов идет на поддержание их роста. Однако в промышленных ферментационных процессах часто необходимо получать максимальные количества определенных метаболитов, и поэтому желательно, чтобы питательные компоненты среды расходовались не для роста бактерий, а для образования ими требуемого продукта. В последнее десятилетие огромное количество исследований направлено на использование бактериальных ферментов или целых клеток, «иммобилизованных» в ферментере, с целью максимально возможного превращения субстрата в необходимый продукт.

Аббот [6] рассматривает иммобилизацию клеток как «физическую локализацию микроорганизмов, позволяющую повторно и экономно их использовать». Можно также определить ферментер с иммобилизованными клетками как устройство, обеспечивающее условия, в которых метаболизм поддержания достигает своего максимума, а рост сводится к минимуму.

Проиллюстрируем этот принцип на примере давно известного «скорого способа образования уксуса», при котором колонии уксуснокислых бактерий в виде пленки находятся в иммобилизованном состоянии на деревянных стружках, заполняющих колонку. Сверху в такую колонку подают этанол, а снизу вверх — воздух, обеспечивающий синтез уксусной кислоты. После образования бактериальной пленки в дальнейшем она почти не растет, тогда как жизнеспособность бактерий поддерживается за счет окисления этанола в ацетат. Такой процесс может продолжаться непрерывно в течение недель или месяцев.

Одним из главных методов иммобилизации клеток остается их физическое прикрепление или химическое связывание с твердым носителем, в то время как для образования скоплений клеток используются другие методы.

Детальное описание методов иммобилизации клеток в ферментерах не входит в задачи этой книги; по этому вопросу существует несколько обзоров [6, 7, 13].

10.4. СБОР И ОЧИСТКА

Выбор способа отделения бактериальных клеток от среды культивирования определяется тем, как в дальнейшем будут использоваться фракции. Так, если собираются изучать клетки, то их отделение путем фильтрования нежелательно, поскольку при этом клетки могут загрязниться материалом, имеющимся в фильтре. Если же будут исследовать культуральную жидкость, то после центрифугирования культуры рекомендуется отбрасывать часть надосадочной жидкости, чтобы избежать ре-суспендирования клеточного осадка при ее удалении.

10.4.1. Фильтрация

Осадочная фильтрация

Для получения бактериальных клеток из культураль-ной среды существуют два типа фильтрации: осадочная и мембранная. Для осадочной фильтрации используют высокопористые материалы. Обычно фильтрующая система состоит из подложки фильтра (фильтровальной бу16 ЖИДКАЯ КУЛЬТУРА

маги или ткани с довольно большим диаметром пор) и толстого нанесенного сверху слоя фильтрующего материала (целлюлозы, диатомовой земли, кизельгура и др.), который легко суспендируется в водных средах с образованием пористого осадка, задерживающего бактерии [57]. При использовании фильтрующего материала увеличивается эффективная поверхностная зона фильтра и соответственно количество бактерий, задерживаемых одним фильтром. Фильтрующий материал можно добавлять непосредственно в культуральную среду или предварительно наслаивать на подложку фильтра. На практике добавление фильтрующего материала, такого, как целлюлоза, в культуральную среду позволяет профильтровать в 10 раз больше жидкости, чем при предварительном нанесении того же количества целлюлозы на подложку фильтра. Однако при таком добавлении значительно возрастают трудности, связанные с извлечением клеток для последующих исследований.

Осадочное фильтрование проводят на воронке Бюх-нера. Ее укрепляют в вакуумной колбе и выстилают высокопористой фильтровальной бумагой (например, ватман № 1). Включают вакуумный насос и на бумагу осторожно и равномерно наливают предварительно приготовленную суспензию кальцифицированной диатомовой земли, так чтобы образовался слой толщиной 2— 5 мм. Поскольку через такой слой фильтрация происходит равномерно, бактерии можно удалять по мере накопления, соскабливая их с поверхности фильтра. Это позволяет проводить довольно длительное фильтрование без замены фильтра.

При осадочной фильтрации из культуральной среды удаляется большинство микроорганизмов, в результате чего получают хорошо просветленный фильтрат. Однако для стерилизации жидких сред этот метод неприменим. Клетки, полученные осадочной фильтрацией, обычно загрязнены большим количеством фильтрующего материала, который может помешать их дальнейшему изучению.

Мембранная фильтрация

В отличие от осадочной мембранная фильтрация основана не на использовании глубоких или извилистых пор фильтрующего материала, а на задержке бактерий

на его поверхности. Бактерии не способны проходить через пор

страница 77
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.11.2017)