Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

поненциального роста клеточная масса удваивалась от двух до пяти раз.

1. Готовят 500 мл стерильной среды в нескольких колбах (например, в 250-миллилитровых колбах Эрленмейера). Инокулируют половину этих колб и инкубируют в соответствующих условиях, а остальные стерильные колбы хранят в тех же условиях.

2. Выращивают клетки в системе периодического культивирования до середины экспоненциальной фазы. Быстро охлаждают культуру до 0—4°С, погружая колбы в ледяную баню. Клетки собирают 10-минутным центрифугированием на холоду при lOOOOg.

3. Осадок клеток ресуспендируют в 2 мл соответствующего ледяного буфера (например, 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 7,0), используя гомогенизатор типа Vortex. Если клетки склонны к агрегации, то для получения суспензии отдельных клеток используют мягкую обработку их ультразвуком или мягкую гомогенизацию (в гомогенизаторе или размельчителе тканей). Для культур, которые особенно плохо поддаются ресуспенди-рованию, можно вначале добавить к буферу 0,01% (вес/

/объем) твина 80, а затем применить ультразвуковую или механическую обработку.

4. Быстро, но осторожно наносят суспендированные клетки на стерильный охлажденный градиент плотности фикола. В зависимости от вида клеток градиент плотности готовят также из сахарозы, коллоидного си-ликазоля или других веществ. В случае градиента сахарозы ее стерильный охлажденный раствор наслаивают в увеличивающихся

Рис. 10.8. Типичная кривая син- концентрациях в простерихронизованной популяции бак- лизованные и охлажденные

терий. до 0°С центрифужные пробирки. Например, вносят в стерильную центрифужную пробирку 10 мл 35%-ной (вес/объем) сахарозы в фосфатном буфере, а затем на этот слой последовательно наслаивают по 10 мл раствора сахарозы разной концентрации (26,5; 25,5; 24,5; 22,0; 19,0 и 15,0%), приготовленного на том же буфере. Все буферные растворы готовят из основного 35%-ного раствора сахарозы. Растворы сахарозы перед использованием следует стерилизовать фильтрованием, хранить на холоду и подвергать предварительной аэрации (в случае аэробных бактерий).

5. Закрытые крышками центрифужные пробирки с клетками аккуратно помещают в охлажденную центрифугу и центрифугируют 15—20 мин при 2500 g на холоду (0°С). Для более точного разделения клеток подбирают скорость и время центрифугирования таким образом, чтобы видимая полоса бактерий передвигалась не более чем на 2/з длины пробирки. И время, и скорость центрифугирования зависят от культуры.

6. 0,5 мл самой легкой фракции клеток из центрифужной пробирки вносят в колбу с нагретой ростовой средой.

7. Тщательно измеряют оптическую плотность иноку-лированной среды, чтобы затем определять ее ступенчатое увеличение, свидетельствующее о синхронном росте культуры.

Синхронность культуры поддерживается в течение двух или трех циклов деления клеток; в случае более длительного периода синхронность приходится устанавливать заново с помощью описанного выше метода. Проточное зональное центрифугирование в градиенте плотности позволяет получать большие количества инокулята для синхронизованного культивирования микроорганизмов. Оно представляется перспективным в обеспечении «непрерывной» синхронизации с помощью рассчитанной во времени инокуляции турбидиметрически регулируемой проточной культуры (турбидостат). На рис. 10.8 показана типичная кривая роста синхронизованной популяции бактерий; видно, что после двух циклов кривая начинает выравниваться.

10.3.4. Периодическое и непрерывное культивирование с диализом

(Ф. Герхардт)

Диализ представляет собой движимый концентрационным градиентом процесс разделения растворенных молекул за счет их различной диффузии через полупроницаемую мембрану. Этот процесс, применимый для роста и поддержания живых клеток, лежит в основе диффузионного метода культивирования.

Существуют и другие процессы, в которых используются мембраны, например электродиализ, ультрафильтрация, микрофильтрация и обратный осмос. Однако для получения клеток и их метаболитов лучше всего использовать именно диализ, поскольку в отличие от других методов при диализе происходит наименьшее засорение мембраны. При культивировании с диализом между культуральной камерой и сосудом с жидкостью помещают мембрану. Для повышения эффективности такого способа культивирования объем диализной жидкости должен быть значительно больше объема диализуемой культуры, или же диализную жидкость следует менять.

Кроме того, мембраны должны иметь достаточную площадь, чтобы обеспечивалась удовлетворительная скорость диффузии. Такая система культивирования с диализом может действовать in vivo или in vitro в периодическом и непрерывном режимах или при их сочетании.

Для культивирования с диализом используются мембраны трех типов, отличающиеся размером пор. Диализные мембраны имеют номинальный размер пор ~10 нм. Они задерживают клетки и макромолекулы, но проницаемы для таких мелких молекул, как основные питательные компоненты, требующиеся бактериям для их роста. Фильтрующие мембраны (или мембранные фильтры) имеют номинальный размер пор ~ 100 нм; они тоже задерживают клетки, но пропускают макромолекулы со сравнительно низкомолекулярной массой. Диализные мембранные трубки различного размера получают из регенерированной целлюлозы путем вискозного процесса (Union Carbide Corp.). Имеются в продаже листы диализной мембраны с большим диапазоном пор, сделанные из различных материалов (Gelman Sciences, Inc., MMli-pore Corp., Nuclepore Corp.). Для бактериологических целей следует принимать во внимание такие факторы, как автоклавируемость мембран, размер их пор, химическая инертность и проницаемость (которая в свою очередь определяется пористостью, емкостью и толщиной мембраны). Мембраны третьего типа, через которые проходят растворенные вещества, не имеют пор и проницаемы для газов, поскольку газы растворимы в мембранном материале, например в резине или поликарбонате.

Для разделения культуры и диализата может использоваться также поверхность раздела двух физически различных фаз (интерфазная диализная культура), например в твердо-жидкой двухфазной системе (разд. 9.2.2).

К специфическим преимуществам использования диализа при культивировании бактерий относятся: 1) удлинение экспоненциальной фазы роста в периодической культуре, что позволяет получать высокие плотности живых клеток; 2) увеличение стационарной фазы роста культур, что позволяет увеличить выход метаболитов, связанных с этой фазой; 3) ослабление контроля путем ингибирования продуктом за счет удаления или разведения продуктов метаболизма, что увеличивает их образование в периодической или непрерывной культуре;

4) установление состояния равновесия с высоким уровнем метаболизма, что позволяет иммобилизовать клетки для длительного образования определенных продуктов;

5) получение метаболитов, свободных от клеток, и, наоборот, клеток, свободных от макромолекул среды;

6) возможность изучения клеточной популяции in situ или при создании in vivo искусственной среды, например в природной экологической обстановке или в организме животного; 7) возможность изучения взаимодействия между популяциями клеток.

История диализной культуры восходит к 1896 г., когда Мечников провел свои опыты с холерными вибрионами. Чтобы изучить способность вибрионов продуцировать растворимый токсин, он помещал их в коллодиевом мешочке в брюшную полость живой морской свинки. История вопроса, общие принципы, математическая теория и практическое применение диализной культуры приведены в исчерпывающем обзоре Шульца и Герхард-та [51]. Опубликован [7] обзор использования принципа диализной культуры иммобилизованных клеток, применяемых в качестве ферментных препаратов (разд. 10.3.5), а в докторской диссертации Стайбера (Университет штата Мичиган, Ист Лансинг, 1979) собраны последние данные по рассматриваемому вопросу.

Системы in vivo

Термин «диффузионная камера» часто используют для описания небольшой диализной культуральной системы, которую имплантируют подопытному животному (например, в брюшину, рубец или под кожу). Она представляет собой пластмассовый цилиндр, закрытый с обоих концов мембранными фильтрами. Из такого цилиндра (типа барабана) можно отбирать пробы. Введенные в жидкую среду внутри цилиндра бактерии растут исключительно за счет диффузии питательных компонентов хозяина. Такие системы используют в бактериологии для изучения иммунных реакций и роста плохо культивируемых патогенов типа Mycobacterium leprae, Treponema pallidum и Neisseria gonorrhoeae.

Системы ex vivo

К системам ex vivo относится, например, следующая. У крупных подопытных животных (допустим, коз) хирургически обнажают сосудистый пучок на шее, выводят наружу и обеспечивают его контакт с диализным мешком, внутри которого содержится бактериальная культура. Такая культуральная диализная система ех vivo позволяет бактериям расти исключительно за счет питательных компонентов крови, причем в культуре отсутствуют макромолекулярные и клеточные защитные механизмы (если используются соответствующие диализные мембраны). В одной из таких систем бактерии находятся в обычном лабораторном ферментере и культура постоянно циркулирует, например через рубашку (с волокнами) для искусственного почечного гемодиализа, которая соединяется трубкой с артерией экспериментального животного [50]. В другой системе бактерии помещают в небольшую (3 мл) камеру из прозрачной пластмассы (поликарбоната), закрытую мембраной, по другую сторону от которой может протекать кровь. Все устройство укрепляют на шее сйободно передвигающегося животного. Такая система неприменима для обли-гатных анаэробов, но она успешно используется для многих факультативных анаэробов, и ее можно применить для изучения реакций между паразитом (специфическим патогеном) и хозяином [26].

Системы in vitro

При культивировании с диализом в лабораторных условиях мембранную диализную трубку с культурой помещают в пробирку, колбу или бутыль со средой, причем ее сгибают таким образом, что она образует полость с двойными стенками, между которыми находится культура (рис. 10

страница 76
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.05.2017)