Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

апробированы.

Термин «турбидостат» относится к любому методу, при котором плотность клеток поддерживается на постоянном уровне. Он включает в себя методы, основанные на изменениях метаболизма, измеряемых с помощью «рН-стата» [48] и «СОг-стата». Поскольку основные метаболические функции (такие, как поглощение бактери ями кислорода, выделение двуокиси углерода и в некоторых случаях изменение рН) тесно связаны со скоростью роста клеток и в конечном счете с удельной скоростью роста культуры, их можно использовать как показательные переменные при регулировке потока среды.

Теоретически в качестве регулируемого параметра при культивировании в турбидостате может быть использован любой параметр, который поддается измерению. На практике же в этом качестве используют только те параметры, которые тесно связаны с ростом клеток. Введение сложных комплексов ферментер — ЭВМ обеспечит более высокий уровень использования турбй-^ достатиой теории, но эти комплексы требуют дальнейших разработок.

10.3. СПЕЦИАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ

10.3.1. Управляемая периодическая культура (рН)

Управляемые периодические культуры нуждаются в специальных приборах, с помощью которых следят за параметрами среды и запуском подачи среды в ферментер таким образом, чтобы регулируемый параметр поддерживался на постоянном уровне. Примером регулируемого параметра среды в ферментере служит величина рН, поддерживаемая на постоянном уровне путем автоматического добавления кислоты или щелочи. Основными компонентами системы контроля рН являются рН-электроды с защитным покрытием, рН-метр, блок автоматического титрования, сосуды с кислотой и щелочью вместе с гибкими шлангами, соединяющими их с ферментером, а также простой перистальтический насос или соленоидный клапан. Хотя можно использовать отдельно рН-электрод и электрод сравнения, чаще применяют стерилизуемый паром объединенный электрод, который занимает меньше места и в без того ограниченном объеме небольшого лабораторного ферментера. Все компоненты системы ферментера, включая рН-электро-ды и электроды для определения растворенного кислорода, должны быть устойчивы к стерилизации паром или другими средствами, например парами окиси этилена или формальдегида.

Особенно надежными считаются электроды фирмы Ingold, которые могут быть автоклавированы многократно. рН-метр и блок автоматического титрования должны подходить друг к другу, поэтому их желательно покупать у одной и той же фирмы. Перистальтический насос надежно обеспечивает подачу кислоты или щелочи против довольно высокого отрицательного давления в ферментере, но при работе с лабораторными ферментерами вполне достаточно использовать простой соленоидный клапан (вентиль), регулирующий по принципу силы тяжести подачу в ферментер щелочи или кислоты. Фирма Radiometer (Копенгаген, Дания) выпускает очень надежные системы для измерения рН и титрования, которые легко приспособить к ферментеру. Системы регулирования рН этой фирмы и электроды фирмы Ingold поставляются их лондонскими отделениями (The London Co.). Системы регулирования содержания растворенного кислорода поставляются всеми основными фирмами, производящими ферментеры; эти системы позволяют контролировать скорость перемешивания среды и скорость подачи кислорода. Особенно надежны электроды для измерения растворенного кислорода, поставляемые фирмой Instrumentation Laboratories, Inc., поскольку они без замены мембраны устойчивы к многократной стерилизации паром.

Регулирование рН описано также в разд. 6.1 и 16.2.1.

10.3.2. Периодическая культура с добавлением субстрата (подпиткой)

В периодической культуре переход от экспоненциальной фазы роста к стационарной может вызываться многими причинами, в том числе нехваткой важного питательного компонента или образованием токсичного метаболита. Если такой переход вызван нехваткой питательного компонента, то при добавлении свежей среды рост культуры будет продолжаться. Чтобы поддерживать экспоненциальный рост культуры с постоянной скоростью, скорость добавления среды и объем культуры в закрытой системе следует увеличивать экспоненциально. Такой способ поддержания роста называют периодическим культивированием с подпиткой [19]. Способ с периодическим удалением культуральной среды, позволяющим добавлять свежую среду, называют длительным периодическим культивированием или отъемно-доливным культивированием. Непрерывное культивирование отличается от периодического, периодического с подпиткой и отъемно-доливного тем, что при нем скорость подачи среды и скорость удаления культуры одинаковы.

Метод периодического культивирования с подпиткой можно использовать в случае потенциально токсичного субстрата, так как при этом его концентрация в среде будет поддерживаться на низком уровне. Культивирование в периодическом режиме с подпиткой является средним между обычным периодическим культивированием^ и непрерывным культивированием. Иногда при периодическом культивировании с подпиткой происходит более значительное увеличение биомассы или выхода продукта, чем при обычном периодическом или непрерывном культивировании. Культивирование в лабораторных условиях по типу периодической культуры с подпиткой легко осуществляется простым добавлением в ферментер самотеком первичных или вторичных субстратов.

Настоящее периодическое культивирование с подпиткой требует, чтобы объем жидкой среды в ферментере увеличивался. Это требование обусловливает верхний предел времени культивирования, определяемый скоростью подпитки, а также изменение условий аэрации и эффективности перемешивания. Кроме того, при этом не исключена возможность обратного заражения свежей среды в сборнике из ферментера; поэтому желательно использовать прерыватель подачи среды (рис. 10.5).

Одним из преимуществ периодического культивирования с подпиткой и длительного периодического культивирования является возможность регулирования скоростей роста. Этот аспект изучен еще недостаточно [4], хотя он может стать ключевым при разработке улучшения процессов промышленного культивирования, например для биосинтеза антибиотиков.

10.3.3. Синхронная периодическая культура

Биохимические процессы, связанные с определенными этапами цикла развития индивидуальных клеток, можно изучать в синхронизированной периодической культуре. Синхронизация культуры наступает в том случае, когда все клетки начинают делиться с почти одинаковой скоростью. При этом зависимость логарифма числа клеток от длительности культивирования приобретает ступенчатый характер в отличие от линейного при обычном росте в периодическом режиме культивирования. Несмотря на то что развитие синхронизованной культуры происходит довольно равномерно, сохранить синхронность в течение длительного времени трудно, поскольку требуется точный контроль.

Синхронизация культуры может быть достигнута путем периодического изменения критических факторов среды. К числу технических приемов, вызывающих синхронизацию деления клеток, относятся подавление, ускорение или задержка их метаболических функций циклическим способом. Популяция постепенно синхронизирует свой ответ на периодические колебания метаболической активности, а затем и показатели роста. Однако этот метод требует значительных отклонений от нормального метаболизма, поэтому его использование ограничено. Единственным исключением является прорастание бактериальных спор как показатель начинающейся синхронизации культуры. Ступенчатые или резкие изменения состава среды могут привести к прорастанию спор и тем самым смоделировать процессы, близкие к естественным. Однако для получения гомогенной популяции (достичь 100%-ного образования спор или их прорастания практически невозможно) требуется применение некоторых физических способов предварительной селекции.

Общепринятый метод синхронизации культур основан на физическом выделении гомогенной фракции из гетерогенной популяции. Такой подход, часто называемый синхронизацией путем селекции, позволяет избежать проблем, связанных с нарушением метаболизма.

Согласно данным Кубитчека [34] и Пула 1[49], в процессе клеточного цикла объем клеток Е. coli возрастает линейно и количество биомассы — экспоненциально. Тот факт, что после деления клетки имеют наименьший объем, наталкивает на предположение, что с помощью центрифугирования (особенно в градиенте плотности) можно получить популяцию новых дочерних клеток из асинхронной культуры. Данные о линейном увеличении объема клеток на фоне экспоненциального роста их массы свидетельствуют о том, что те клетки, которые готовы к делению, или те, которые уже разделились, имеют самую высокую плотность, несмотря на различия в их размерах. С помощью центрифугирования в градиенте плотности можно получить несколько фракций клеток, причем фракция с наибольшей плотностью будет содержать и молодые (дочерние), и зрелые (готовые к делению) клетки, а фракция с наименьшей плавучей плотностью будет содержать гомогенную популяцию клеток, которые находятся в одинаковой стадии роста.

При синхронизации пугем селекции в результате центрифугирования в градиенте плотности нет возможности получить новые дочерние клетки для непосредственного изучения физиологии их роста, поскольку во фракциях, содержащих эти клетки, всегда присутствуют зрелые клетки, готовые к делению. Однако с помощью центрифугирования в градиенте плотности можно получить инокулят для роста синхронизованной культуры. Затем путем прямого отбора проб из нее можно изучать физиологию бактерий, связанную с их клеточным циклом. Ниже описан главный метод получения синхронизованных культур, в основе которого лежит метод Митчисона и Винсента [43]. Этот метод можно использовать в качестве начального этапа синхронного культивирования, имеющего свои характерные особенности в случае каждого изучаемого микроорганизма [37].

Метод синхронизации путем селекции

К экспериментам по синхронизации приступают только тогда, когда определены основные условия периодического культивирования, в том числе кинетика асинхронной культуры. После этого устанавливают режим периодического культивирования таким образом, чтобы в течение экс

страница 75
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2017)