Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

я этого канала специальным «прерывателем», который действует по типу асептического затвора между ферментером и резервуаром со свежей средой. Рис. 10.5 иллюстрирует основной принцип такого прерывателя [21]. Его нижняя часть обеспечивает медленную, но постоянную подачу стерильного воздуха, предотвращая тем самым аэрозольное заражение канала, через который поступает среда. Верхняя камера устройства обеспечивает дополнительное прерывание потока поступающей жидкости. Этот прерыватель может быть использован как для периодического культивирования с добавлением субстрата, так и для непрерывного культивирования.

Рис. 10.5. Прибор для предотвращения заражения среды в сборнике при непрерывном или периодическом ( с подпиткой) культивировании.

Сборники и приемники

Непрерывное культивирование требует довольно больших объемов среды и приводит к образованию соответствующих больших объемов культуральной жидкости с конечным продуктом. В табл. 10.4 представлены объемы свежей среды, необходимые для 20-часового непрерывного культивирования при различных скоростях разбавления. Для удобства там же приведено соответствующее время удвоения биомассы. Чтобы иметь возможность варьировать скорость подачи среды в случае 20-часового культивирования, рекомендуется готовить достаточное количество среды. Поскольку в большинстве лабораторных операций стерилизацию проводят путем автоклавирования, предпочтительнее готовить требуемые объемы среды в бутылях соответствующего размера.

Таблица 10.4. Количество среды, необходимое для непрерывного культивирования при различных скоростях разбавления"

Скорость раз бавления , чСоответствующее время удвоения биомассы

мин

Отношение объема среды

к объему ферментера, необходимое для 20 часового непрерывного культи вирования, мл/мл

(С большими объемами горячих жидкостей нужно обращаться с предельной осторожностью. Вместо стеклянных лучше использовать пластмассовые бутыли, которые можно автоклавировать.) Например, для культивирования в течение 20 ч в 14-литровом ферментере с 10-литровым рабочим объемом, в котором клетки бактерий удваиваются каждый час (скорость разбавления 0,69 ч-1), необходимо 138 л свежей среды. При тех же условиях культивирования для рабочего объема жидкости 1 л необходимо 13,8 л среды.

Небольшие объемы среды можно легко автоклавировать и хранить в стандартных 20-литровых бутылях. При приготовлении небольших объемов среды (10—14 л) ее удается стерилизовать без избыточного нагревания. Для хранения стерильной среды годятся полипропиленовые или поликарбонатные бутыли, имеющиеся в продаже. На рис. 10.6 схематически изображен типичный резервуар со средой, который стерилизуют в вертикальном положении путем автоклавирования. Объем среды не должен превышать 75% объема резервуара, иначе возможно выплескивание среды во время ее автоклавирования. Кроме того, во время автоклавирования необходимо выпустить газ из сосуда. После стерилизации несколько бутылей можно объединить вместе, увеличив тем самым общий объем резервуара. Для этого трубку 1 первого сосуда соединяют с трубкой 2 второго и т. д. (рис. 10.6).

Стерильные соединения сосудов

Для соединения сосудов между собой и с ферментером используют специальное устройство, изображенное на рис. 10.7. Оно состоит из двух секций стальных трубок, подобранных таким образом, что одна трубка легко входит в другую. На наружные концы этих трубок плотно надеваются резиновые шланги. Каждую трубку устройства перед автоклавироваиием заворачивают в алюминиевую фольгу. Чтобы стерильно соединить их, следует осторожно снять алюминиевую фольгу, обжечь на огне каждую трубку и плотно вставить трубку меньшего диаметра в трубку большего диаметра. Более тонкая трубка должна быть несколько длиннее, чтобы она проходила через всю большую трубку и соединялась с насаженным на нее резиновым шлангом. Для большей надежности место соединения стальной трубки с резиновым шлангом скрепляют проволокой или небольшим стягивающим зажимом. Устройство для быстрого соединения следует располагать таким образом, чтобы более широкая трубка своим открытым концом была направлена вертикально вниз. Для надежности все устройство заворачивают в стерильный защитный материал, чтобы ю. ЖИДКАЯ КУЛЬТУРА

Резинобо^ трубка Металлическая трубка

Рис. 10.7. Муфта для быстрого и стерильного соединения трубок и сосудов в системе непрерывного культивирования. Вверху: муфта в разобранном виде. Внизу: собранная муфта.

предотвратить попадание в трубки пыли и содержащихся в воздухе микроорганизмов. Эти предосторожности позволяют разъединять трубки и после стерилизации на огне вновь их соединять. Когда меняют сосуд, соединительное устройство освобождают от защитного материала; для надежности перед соединением со следующей стерильной линией более тонкую трубку следует об жечь на огне.

Стерилизация среды

Стандартные приемы стерилизации жидких сред описываются в гл. 23 этого руководства. Для предотвращения распада термолабильных компонентов среды используют стерилизацию фильтрованием. Небольшие объемы простых сред, используемых для культивирования бактерий, автоклавируют непосредственно перед их использованием, но для автоклавирования больших объемов

среды необходимо довольно длительное время. Так, в зависимости от состава среды сосуды, содержащие около 10 л жидкости, следует автоклавировать от 30 до 90 мин при 121 °С. Для полной стерилизации 10-литровых объемов среды, содержащей такие компоненты, как кукурузная или соевая мука, требуется до 90 мин, тогда как среды, содержащие только растворимые компоненты, можно стерилизовать в течение 30 мин при 121 °С. Во время автоклавирования все сосуды следует соединить друг с другом для уравновешивания давления.

При автоклавировании больших объемов предварительно восстановленных сред для анаэробных бактерий необходимо особо тщательно установить, а затем и поддерживать химически восстановленное состояние этих сред. Сосуды, содержащие предварительно восстановленные среды, немедленно после автоклавирования подсоединяют к источнику с газом, не содержащим кислород. Как только в верхнем пространстве сосуда начинает конденсироваться пар, там создается частичный вакуум. Продувание газа без 02 позволяет ослабить вакуум, образованный во время охлаждения сосуда, и предотвратить попадание в среду кислорода из воздуха.

Запуск

Непрерывному культивированию всегда предшествует непродолжительное периодическое культивирование, в процессе которого за счет избытка субстрата происходит накопление биомассы. Непрерывное культивирование следует начинать в тот момент, когда в периодическом режиме культура достигнет экспоненциальной фазы роста. При этом уменьшаются колебания, вызываемые подачей среды, и исключается непредусмотренное вымывание культуры, связанное с наличием лаг-фазы. Разбавление начинают со скоростью, меньшей, чем это требуется, и затем постепенно увеличивают ее до нужной величины. Такой прием позволяет уменьшить колебания роста, вызываемые токсичными субстратами, например фенолом. Реакция культуры в хемостате на токсичные субстраты более подробно обсуждается в работе Перта

МОтбор проб

Лучше всего производить отбор проб культуры через специальный отвод в ферментере. Иногда их отбирают также из выводной трубки ферментера, но это не рекомендуется делать при отборе малых объемов, поскольку на стенках выводной трубки могут находиться бактерии; при их попадании в пробу могут быть получены искаженные результаты. При отборе проб в процессе непрерывного культивирования необходимо следовать инструкции фирмы — изготовителя ферментера. Если пробы отбирают не из выводной трубки, а через специальный отвод, их объем должен составлять менее 10% рабочего объема ферментера, так чтобы равновесие системы нарушалось не сильно. Трубку для отбора проб следует предварительно тщательно очищать. Некоторые ферментеры оборудованы воздушной системой очистки, которая обеспечивает сброс в ферментер содержимого трубки после отбора проб. При использовании этой системы нет необходимости в ее предварительной очистке.

10.2.2. Турбидостат

Турбидостат представляет собой самую простую из всех хорошо перемешиваемых систем непрерывного культивирования [61]. Концентрация клеток в ней регулируется постоянной подстройкой определенной скорости поступления питательных компонентов. В отличие от случая хемостата концентрацию биомассы в турбидоста-те выбирает оператор, а скорость разбавления и соответственно концентрация субстратов поддерживается таким образом, чтобы сохранялся заданный уровень биомассы. Отсюда следует, что если нет необходимости в лимитирующих количествах субстрата, то он добавляется в избытке. Поэтому работа системы (для используемой среды) наиболее стабильна при удельной скорости роста культуры, близкой к максимальной u-max- Пока концентрация всех компонентов среды избыточна, система работает в широких интервалах концентраций биомассы при скорости разбавления, близкой к критической. Именно в этих условиях хемостат наименее стабиЧАСТЬ И. РОСТ

лен. В отличие от того, что мы им^ем в случае хемоста-та, скорость разбавления в турбидостате при тщательном регулировании биомассы всегда равна удельной скорости роста, независимо от того, находится система в состоянии равновесия или нет.

Наиболее уязвимым местом культивирования в турбидостате является точность регулирования биомассы. Большинство старых методов регулирования плотности популяции основано на оптическом измерении (в рассеянном или проходящем свете) с помощью фотоэлектрического датчика. Недостатком этих методов являются помехи, вызываемые пеной и пузырьками, которые образуются при аэрации, а также ростом клеток на стенках ферментера и, что более важно, на оптическом измерительном устройстве. Если от помех, вызываемых пузырьками, можно избавиться, используя внешнюю проточную кювету, то пена создает серьезные проблемы. Зарастание бактериями оптических поверхностей можно частично преодолеть их протиранием, однако это малоэффективный прием. Возлагаются надежды на новые методы волоконной оптики, однако они еще не

страница 74
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.05.2017)